利用者:Tarepan/sandbox

creating

ラウドネス正規化 XはAである 。

英: placeholder

XはたしかにAである

ネットワークは関数の合成、すなわち $l-1$ 段目の出力 $x_{l-1}$ を次段の関数 $f_{l}$ の入力とする計算 $x_{l}=f_{l}(x_{l-1})$ を全段階で連鎖する構造となっている。

複製（著作権法）

日本の著作権法体系における著作物の複製（ちょさくぶつのふくせい）は、依拠する著作物の表現上の本質的な特徴を維持しつつ、これを形あるものへ再製することである。

定義

著作物の複製は著作権法で明文定義されている。一方でその解釈が裁判で争われてきた経緯があり、日本の著作権法体系においては判例で示された定義解釈の理解もまた重要である。

著作権法

著作権法は法第2条15で次のように複製を定義している：

（定義）

第二条　この法律において、次の各号に掲げる用語の意義は、当該各号に定めるところによる。

十五　複製　印刷、写真、複写、録音、録画その他の方法により有形的に再製することをいい、次に掲げるものについては、それぞれ次に掲げる行為を含むものとする。
　イ　脚本その他これに類する演劇用の著作物　当該著作物の上演、放送又は有線放送を録音し、又は録画すること。

　ロ　建築の著作物　建築に関する図面に従つて建築物を完成すること。
— 著作権法（令和五年法律第三十三号による改正）

すなわち、著作権法の明文規定において、複製とは「有形的に再製すること」である。

判例

最高裁判所は複製と関係の深い翻案を次のように定義・解釈している（江差追分事件）：

 １　言語の著作物の翻案とは，既存の著作物に依拠し，かつ，その表現上の本質的な特徴の同一性を維持しつつ，具体的表現に修正，増減，変更等を加えて，新たに思想又は感情を創作的に表現することにより，これに接する者が既存の著作物の表現上の本質的な特徴を直接感得することのできる別の著作物を創作する行為をいう。 — 最高裁判所、損害賠償等請求事件 平成11(受)922

この翻案の定義に基づき、判例上の解釈として、複製とは「依拠する著作物の表現上の本質的な特徴を感得できる形で再製すること」と解される。

旧著作権法

最高裁判所は旧著作権法下における複製を次のように定義・解釈している（ワン・レイニーナイト・イン・トーキョー事件）：

著作物の複製とは、既存の著作物に依拠し、その内容及び形式を覚知させるに足りるものを再製することをいう — 最高裁判所、著作権不存在等確認及び著作権損害賠償 昭和50(オ)324

RISC-V仕様

core: A component that contains an independent instruction fetch unit

hart: A RISC-V-compatible hardware thread, which can be multiple in a core (multithreading)

coprocessor:

the ISA is one component of the EEI

RISC-V ISAは1つの base integer ISA と0個以上の extensions から構成される。

The base integer ISAs are very similar to that of the early RISC processors except

- with no branch delay slots

- with support for optional variable-length instruction encodings

XLEN=32|64 - the width of an integer register in bits

"RISC-V has been designed to support extensive customization and specialization."

we divide each RISC-V instruction-set encoding space (and related encoding spaces such as the CSRs) into three disjoint categories:

standard/reserved/custom

standard: Defined by the Foundation, and shall not conflict with other standard extensions for the same base ISA

reserved: currently not defined but are saved for future standard extensions

custom: shall never be used for standard extensions (not defined by the Foundation) and are made available for vendor-specific non-standard extensions

- “I”: The base integer ISA

- integer computational instructions

- integer loads

- integer stores

- controlflow instructions

- “M”: The standard integer multiplication and division extension

- multiply and divide values held in the integer registers

- “A”: The standard atomic instruction extension

- atomically read, modify, and write memory for inter-processor synchronization

- “F”: The standard single-precision floating-point extension

- floating-point registers, single-precision computational instructions, and single-precision loads and stores.

- “D”: The standard double-precision floating-point extension

- floating-point registers, and adds double-precision computational instructions, loads, and stores

- “C”: The standard compressed instruction extension provides narrower 16-bit forms of common instructions.

メモリ:a single byte-addressable address space of 2^XLEN bytes for all memory accesses. word = 32 bits (4 bytes)

The base RISC-V ISA has fixed-length 32-bit instructions

However, the standard RISC-V encoding scheme is designed to support ISA extensions with variable-length instructions, where each instruction can be any number of 16-bit instruction parcels in length and parcels are naturally aligned on 16-bit boundaries. The standard compressed ISA extension described in Chapter 16 reduces code size by providing compressed 16-bit instructions and relaxes the alignment constraints to allow all instructions (16 bit and 32 bit) to be aligned on any 16-bit boundary to improve code density.

RV32I

RV32I base integer instruction set.

40種: LUI/AUIPC/JAL/JALR/BEQ/BNE/BLT/BGE/BLTU/BGEU/LB/LH/LW/LBU/LHU/SB/SH/SW/ADDI/SLTI/SLTIU/XORI/ORI/ANDI/SLLI/SRLI/SRAI/ADD/SUB/SLL/SLT/SLTU/OXR/SRL/SRA/OR/AND/FENCE/ECALL/EBREAK

RV32I was designed to be sufficient to form a compiler target and to support modern operating system environments. The ISA was also designed to reduce the hardware required in a minimal implementation.

RV32I contains 40 unique instructions, though a simple implementation might cover the ECALL/EBREAK instructions with a single SYSTEM hardware instruction that always traps and might be able to implement the FENCE instruction as a NOP, reducing base instruction count to 38 total.

RV32I can emulate almost any other ISA extension

(except the A extension, which requires additional hardware support for atomicity). In practice, a hardware implementation including the machine-mode privileged architecture will also require the 6 CSR instructions. Subsets of the base integer ISA might be useful for pedagogical purposes, but the base has been defined such that there should be little incentive to subset a real hardware implementation beyond omitting support for misaligned memory accesses and treating all SYSTEM instructions as a single trap.

レジスタ: 32bitが32本。x0が全bit0で、x1~x31がGPレジスタ。更に program counter pcを有する。

For RV32I, the 32 x registers are each 32 bits wide

命令フォーマット: R/I/S/U-type

レジスタは32本=5bit

opcodeを頭に、即値（の一部）を尻尾に置き、

Interger ops

register-immediate: I-type (

R-type: register-register

Integer computational instructions are either encoded as register-immediate operations using the I-type format or as register-register operations using the R-type format.

ADDI、SLTI (set less than immediate)、ANDI, ORI, XORI

F standardで floating-point register (f0~f31) が導入される

科学的管理法

	direction	efficiency	focus
	×	○	○	意味ないところに素早く着く
	○	×	○	目的地にフラフラしながら着く
	○	○	×	たまにコケながら目的地へ真っ直ぐ着く

Under scientific management the "initiative" of the workmen (that is, their hard work, their good-will, and their ingenuity) is obtained with absolute uniformity and to a greater extent than is possible under the old system; and in addition to this improvement on the part of the men,

マネジメントの新しい役割:

- gathering/classifying/tabulating knowledge

- reducing knowledge to rules, laws, and formulae

#2

[it] is impossible

in a few words to make [it] clear to one not familiar with this problem

why it is that the ignorance of employers as to the proper work time makes it for the interest of the workman to "soldier."

why it is that the ignorance of employers as to the proper time in which work of various kinds should be done makes it for the interest of the workman to "soldier."

it is impossible in a few words to make it clear to one not familiar with this problem why it is that the ignorance of employers as to the proper working time makes it for the interest of the workman to "soldier."

The writer therefore quotes herewith from a paper read before The

American Society of Mechanical Engineers, in June, 1903, entitled "Shop

Management," which it is hoped will explain fully this cause for

the managers assume new burdens, new duties, and responsibilities never dreamed of in the past. The managers assume, for instance, the burden of gathering together all of the traditional knowledge which in the past has been possessed by the workmen and then of classifying, tabulating, and reducing this knowledge to rules, laws, and formulae which are immensely helpful to the workmen in doing their daily work. In addition to developing a science in this way, the management take on three other types of duties which involve new and heavy burdens for themselves.

1. develop a science for each element of a man's work

2. scientifically select and then train, teach, and develop the workman, whereas in the past he chose his own work and trained himself as best he could

3. cooperate with the men so as to insure all of the work being done in accordance with the principles of the science which has been developed

4. There is an almost equal division of the work and the responsibility between the management and the workmen

何でもかんでも職人が担っていたので、マネジメントときっちり分業する

It is this combination of the initiative of the workmen, coupled with the new types of work done by the management, that makes scientific management so much more efficient than the old plan.

「業務の科学、適切な人員配置と教育、執行の統制、責務の明確な分離」

課業と運用体制の構築をマネジメントの責務へと分離し、作業者を実運用に専念させた。

"initiative and incentive" 型: 報奨を用い、知識と経験をもった職人に良い働きをしてもらう

"scientific management" 型: マネジメントがタスクをデザインする

業務の理解 (science)、計画 (design)、執行 (operation)、評価（evaluation）

PDC-A

凄くスケールする産業であれば、インセンティブを削らず上乗せしていっても利益がちゃんと出せる。工場での人手による生産はスケールしない。

知識をオープンにするとそれをすでに習得した新人がどんどん供給されるため、長い目で見ると賃金に対する要求水準が上がっていく。なのでインセンティブが青天井にならずに済む。

スケールする産業の場合、効率向上とその公開に対してインセンティブを設計するのが妥当。こうすれば効率が上がりつつも青天井を防げ、win-winになる。

パターン

アセンブリ言語で書かれたコードには頻出するパターンが存在する。

関数

アセンブリ言語に関数は存在しないが、関数に相当するパターンが存在する。

関数は引数を受け取り、ローカル変数を確保し、ボディの命令を実行し、戻り値を返すルーチンである。このルーチンを呼び出す場合、制御が戻るポイントを控え、引数を用意し、ルーチンへ制御を移して実行し、戻り値を記録し、戻りポイントへ制御を移す。

• 引数の準備
• サブルーチン終了後の復帰ポイントメモ
• ローカル変数の確保
• サブルーチン冒頭への制御移行

これらの処理によりサブルーチンへ制御が移り、関数ボディの命令列が実行される。関数命令の最終行が実行されたのち、次の処理が必要となる。

• ローカル変数の解放
• 引数の解放
• 復帰ポイントへの

これらの処理によりメインルーチンへ制御が復帰する。

このパターンは関数の処理内容に関わらず普遍的である。前半の関数呼び出しに相当するパターンを関数プロローグ（英: function prologue）という。後半の関数からの復帰に相当するパターンを関数エピローグ（英: function prologue）という。

関数プロローグ・エピローグは同じ結果が得られるいくつかのパターンが存在する。例えば引数をスタックに積むパターンとレジスタに置くパターンがある。

自動変数

自動変数（英: automatic variable）は変数宣言・スコープ脱出によりメモリが自動確保・開放される変数である。

自動変数では変数宣言とスコープで生存期間が規定され、変数宣言により自動で寿命が始まり（メモリが確保され）スコープ脱出時に自動で寿命が終わる（メモリが解放される）。

ローカル変数/グローバル変数は変数の参照可能範囲（スコープ）に基づく変数の分類であり、自動変数とは別の概念である。自動変数ではないローカル変数、すなわちスコープを脱出すると参照はできなくなるがメモリ上に残り続ける変数がプログラムできる。

例

C言語

C言語における auto キーワードは変数が自動変数であることを明示的に指定する。ローカル変数はデフォルトで（auto 無しで）自動変数となり、明示的に static キーワードを用いるとスコープ脱出時にメモリが解放されなくなる。

関連項目

• 変数 (プログラミング)
• メモリ管理
• ローカル変数 / グローバル変数
• デストラクタ

分業

	ブランディング・販売	企画・設計	組立・製造	流通	小売
一般	メーカー			卸	専門店/小売店
		ODM
			OEM
衣料品	SPA (製造委託有)
半導体デバイス	IDM
	ファブレス		ファウンドリ
電子機器			EMS
スマホ		IDH

実装

表. Intel CPU AVX2におけるint8積和演算 (pseudo VNNI) 実装

μarch	Load			Store	VPMADDUBSWVPMADDWD			VPADDD			VNNI
	実行ユニット		スループット		実行ユニット			実行ユニット					スループット
	数	ポート			名前	数	ポート	名前	数	ポート
Haswell	2	#2, 3	64 Byte		SIMD Misc	1		SIMD ALU	2	#1, 5			-
Skylake	2	#2, 3	64 Byte		Vec Mul	2	#0, 1	Vec ALU	3	#0, 1, 5			-
Sunny Cove	2	#2, 3			Vec Mul	2		Vec ALU	3	#0, 1, 5
Golden Cove	3	#2, 3, 11		x2	Vec Mul/FMA	2	#0, 1	Vec ALU	3	#0, 1, 5			0.5 CPI
Gracemont

EU LDU L2 peak L2 sustained

Haswell: 0.5 [pVNNI/cycle], 2 [YMM/cycle], 2 [YMM/cycle], N/A

Skylake: 1 [pVNNI/cycle], 2 [YMM/cycle], 2 [YMM/cycle], 0.9 [YMM/cycle]

SnyCov: 1 [pVNNI/cycle], 2 [YMM/cycle], 2 [YMM/cycle], 1.5 [YMM/cycle]

GldCov: 2 [ VNNI/cycle], 3 [YMM/cycle]

L2からweightを引っ張るにはr-L2の帯域が必要

1 VNNI => 8x4=32 MACC/cycle

3 GHz => 96 GMACC/sec

Y' <- MACC(W', X', Y') でY'をレジスタに乗せ続ければ W'とX' を供給し続ければいい => 2 [YMM/cycle]

レジスタの許す限りY'幅を広げて、X'のreuseを上げられる. デフォルトでreuse=8, 幅倍率Nで8N reuse. 例えばN=5なら 1.03 [YMM/cycle]

Y[k] <- MACC(W', X', Y[k]) でX'をレジスタに乗せ続ける場合、Y[k]の load/storeが必須. 4Nでreuseを上げられて、N=5なら1.05 [YMM/cycle]

どっちにせよ8~9割くらいは使い切る感じ.

価値提案 - 背景

バリュープロポジションはラニングとマイケルズにより1998年に提案された。彼らはIBMがマーケティングによる押し込みではなく、信頼性に価値を置く顧客セグメントへ信頼性を重視したプロダクトを提供することで競争優位を築いていたと見出した。またDECとの比較から、IBMの凋落が押し込みの失敗でなく、環境と顧客嗜好の変化（信頼性ベース価値の低下）によりDECがIBMより優れた"value proposition"を提供するようになったことが原因だと分析した。そしてIBMの再興にはビジネスシステムを再構築し"value proposition"を変える必要があると推察した。

顧客は価値を知覚する。企業は価値提案を掲げ、全社がそれに従って顧客に価値を届けられるよう頑張る。

A business unit promises customers some value ... It thus offers a value proposition.

If a customer group finds a business unit's value proposition superior, the business unit can be said to have delivered a superior value to that group.

企業から顧客候補への価値提案。顧客は価値提案から価値を見積もる（delivered）。顧客は複数企業からの提案を見比べて価値を類推し、いいやつを実際に選ぶ。だから優れた価値提案&deliveryこそが競合優位を決定づける。という理屈。

優れた戦略の背景には優れた価値提案がある（と思っている）。

valueは消費時に発生するとは限らない。value見込み、予期的UX的なものも含む.

顧客が感じるのが価値、顧客にどう感じて欲しいか企業が掲げるのが価値提案.

"superior value delivery"

<- choosing the superior value proposition

<- echoing value proposition everywhere in the company

-> provide or communicate the value

"IMPORTANCE OF ECHOING"

"Often, the difference in a winning strategy is NOT the choice of value proposition but the thoroughness, single-mindedness, and innovation with which it is provided and communicated."

"Differentiating the winners is the extent to which this value proposition is echoed in the business system"

「掲げられた顧客価値」

この価値を実現すべく製品が開発され市場へ提供されるし、マーケ部は「この価値があるんだよ」と顧客に納得してもらえるようコミュニケーションをとる。

やっぱりmissionに近い?

"Understanding why customers make one selection over another is thus critical to achieving competitive advantage."

Management may choose a value proposition but find it infeasible to provide or communicate. They then reformulate their choice.

Often, management actually discovers that the company already delivers a superior value proposition, then builds on this discovery.

価値提案を構築するのはトップマネジメントの最重要活動である。この活動はしばしばマーケティング部門や経営企画部へ委譲されるが、

Explicit/Specific/Clearly

- 1/Benefits

- 2/Price

- 3/Target customer

- 4/how superior for target segment

Evidence of

- 5/demand

- 6/returns

7/Viable in light of competitors' value propositions

8/Feasibility

9/Become best in several value propositions considered

10/clear and simple

chooses the appropriate specific value proposition.

"A business unit promises customers some value, a combination of benefit and price. It thus offers a value proposition."

- the entire set of experiences that an organization brings to customers, including value for money.

- all benefits

- favourable points of differences

- resonating focus

an explicit promise made by a company to its customers that it will deliver a particular bundle of value creating benefits (Buttle, 2009). In other words, “the value proposition is a written statement focusing all the organization’s market activities onto customer critical elements that create a significant differential within the customer’s decision process, to prefer and/or purchase the organization’s offering over a competitor’s” (Fifield, 2007: 443).

Lanning (1998: 55) defines the value proposition as an entire set of experiences, including value for money that an organization brings to customers. Customers may perceive this set or combination of experiences to be “superior, equal or inferior to alternatives”.

音素分析

音声や文章を分析することで対応する音素が得られる。そのための様々な分析手法が存在する。

manual phonetic segmentation

Automatic phonetic segmentation

, by using a pronouncing dictionary and/or grapheme to phoneme rules.

• 音素アライメント（英: Phoneme Alignment）: 与えられた音声-音素列の時間的対応づけ（アライメント）
  • Forced: 尤もらしいものに強制的対応付け

WaveRT Port Driver

（

前世代: WaveCyclic port driver, WavePci port driver

Windows OSが提供する音声用クラスドライバの一種。

たぶん、miniport driverとペアをつくり単一のWDM Driverとして機能する. （なんか違うっぽい。用語集のところ）

• WDM Audio Miniport Driver
• WDM Audio Adapter Driver
• WDM Audio Port Driver

"KS filter"

KMixer system driver : いわゆるカーネルミキサー. KS filterとして動くドライバ. `Kmixer.sys`

デバイスドライバへの要求

• 複数アプリケーションからの同時アクセスに対する調停（現代のOSはマルチプロセス）

Windows Vista~

driver triplet

根底にあるポイント: ドライバもCPUで動く命令のかたまり、ただのプログラム。デバイスへのアクセスをしばしばおこなうのが違い。

Windows デバイスドライバ

• Driver type
  • Device function driver (function driver)
  • Device filter driver
  • Software driver: デバイスと無関係のドライバ. 対応するDriver model: KMDF, (legacy) Windows NT driver model
  • File system filter driver
  • File system driver

device object: instance of DEVICE_OBJECT struct

基本的な見方: I/O & デバイス制御リクエストが device tree へ発行され、device node で処理されながら tree を伝播していく

• Plug and Play device tree (a.k.a. device tree)
  • device node - device stack - (device object, driver(xx.sys))xN
    • function driver: just 1 for stack, handling read/write/device_control_requests
    • filter drivers: 0~many, auxiliary roles in processing read/write/device_control_requests

FDO, FilterDO, PDO, WDF DO (user-mode),

device node: a device | an individual function on a composite device (Logical entity, not always link to physical entity)

(Logical) Device, Controller, Adapter, Port, Hub, etc...

physical device object (PDO): Bus device node に属する driver が Physical bus に問い合わせて接続が確認されたとき、それ用に生成されるDO.

PnP ManagerがPOをdevice nodeに結びつけ、レジストリの情報から他の必要なdriver群をくっつけ device stackを完成させる. なのでPOがいつも最初.

function driver と filter driver はロード後にDOを生成しstackに追加する

I/O request to device -> driver**s** work

However, some nodes represent software components that have no association with physical devices.

リクエストの実体: I/O request packet ;IRP

IRPは device node で処理されながら伝播していくので、IRPからみると複数の device stack に含まれる driver の総体で処理される -> driver stack for the request (c.f. device stack)

Driver stack を構成する各driverをみると役割分担がなされていて、それでグルーピングしたものを technology driver stack という

例: USB Core Driver Stack, Storage Stack, 1394 Driver Stack, Audio Driver Stack.

DRIVER_OBJECT struct

driverが実装してる関数のポインタ集合？ たぶんCでclassがないので関数ポインタみたいな話かと

.Unload, .MajorFunction: array of pointers

Port-miniportモデルの場合、portの汎用機能でinitするという形

> The driver pair forms a single WDM driver that is at one level in the device stack.

Device Object と紐づく "a driver" に対応しているのがDRIVER_OBJECT. port-miniportは "a driver" 内の話.

• technology-specific driver pair models
• KMDF as a generic driver pair model

2層アーキテクチャは広く用いられているけど、共通のライブラリやインターフェースがあるわけでもなく、結局は各分野ごとに全然違う実装.

=> 分野を問わない class driver 基盤を用意しようぜ => Framework of KMDF: (Framework, MKDF driver) pair で "a driver" を構成する.

"a single WDM driver"

たぶんだけど、IRPやdevice nodeの概念がWDMで規定されてる.

そこの理解は核心なので、必ず確認.

table

	適応対象	適応反映
スプリントプランニング	-	-
デイリースクラム	仕掛け品	スプリントバックログ（PBI & 手順）
スプリントレビュー	プロダクト/インクリメント	プロダクトバックログ（PBI）
スプリントレトロスペクティブ	開発工程	開発工程

gm

確率的グラフィカルモデルは確率分布を表現する方法の1つである。このモデルでは確率変数をノード、変数間関係をリンクとするグラフ/ネットワークにより確率分布を表現する。

生成モデル

生成モデルは確率的なデータ生成過程のモデルである。

$x\thicksim p_{model}(x;\theta )$

確率密度関数を陽に得るか否かで分類される。

explicit/prescribe: $x\thicksim p_{model}(x;\theta )$

implicit: $x=G(z;\theta ),\quad z\sim p_{latent}(z)$

implicitモデルでは潜在確率変数の変換によりデータを生成し、データの密度関数をimplicitに推定する。

密度関数 を陽に推定する（explicit density estimation）か、確率変数の変換すなわちデータ生成関数により暗に密度推定をおこなうかで分類される。

implicitモデルはデータの生成をモデル化しているので、サンプリングが容易なp(z)を用意すればデータ生成が容易におこなえる。explicitモデルの場合、密度関数からのサンプリングが必要であり、場合によってはマルコフ連鎖モンテカルロ法などを用いる必要が出てくる。

表: 生成モデル

クラス	密度表現	学習	例
自己回帰	explicit	最尤推定
GAN	implicit	敵対的学習	(vanilla) GAN, ,

Implicit generative models: pxを陽に定義せず、潜在確率変数zの変換によりxを生成、暗示的に確率分布を得る.

zを変換する関数はしばしば生成器/Generator, Decorderと呼ばれる。

Implicit generative models use a latent variable z and transform it using a deterministic function Gθ that maps from R m → R d using parameters θ.

Either

Eitherはプログラミングにおけるパターンの一種で、失敗・成功といった相反する2つの値を1つの値として扱うものである。Eitherモナドとも呼ばれる。

概要

英単語 either は"either A or B" で「AあるいはB」という意味を持つ。プログラミングにおけるEitherパターンは「エラーあるいは値」のように相反する2つの値を1つの値として表現する。Eitherのうち片方は Left他方はRightと呼ばれる。

// variable 'eitherErrorOrValue' as Right
let eitherErrorOrValue: Either<Error, Number> = Either.right(1);
// variable 'eitherErrorOrValue' as Left
eitherErrorOrValue                            = Either.left(new Error("I am proper Error"));

Eitherは関数適用のされ方に特徴がある。Eitherで包まれた値（上記の "1" あるいは "Error"）にはmapを介して関数を適用するが、Leftに関数を適用すると「関数を適用しなかった」ように振る舞い、Rightに関数を適用するとそのまま包まれた値へ関数が適用される。

const plus1 = (input: number) => input + 1;

// apply 'plus1' toward Right
const eitherR = Either<Error, Number>.right(1);
const resultR = eitherR.map(plus1); // apply plus1
console.log(resultR._value); // 2

// apply 'aplus1' toward Left
const eitherL = Either<Error, Number>.left(new Error("I am proper Error"));
const resultL = eitherL.map(plus1); // pass through
console.log(resultL._value); // I am proper Error

Right(1)に関数plus1を適用すると包まれた値にplus1が適用されてRight(2)となる。一方Left(Error)に関数plus1を適用すると単にパスされLeft(Error)のままとなる。 Eitherパターンを利用しない場合、Errorに対してplus1を適用しようとしても型が合わずエラーを吐いてしまう。Eitherパターンを利用することで相反する2つの値をあたかも1つの値であるかのように扱える。この特徴によりエラーの場合は処理をパスし成功の場合は処理を続けるというパターンがシンプルに記述できる。例えば「データ取得が成功すればデータの変換をおこない失敗した場合はただエラーを通知する」が次のように記述できる。

// function which could result in Error or 1
declare function getIntData(): Either<Error, Int>;

// processing funcs
const plus1 = (input: number) => input + 1;
const plus2 = (input: number) => input + 2;
const plus3 = (input: number) => input + 3;

// chain with Either pattern
getIntData()  // Left(Error) | Right(1)
  .map(plus1) // Left(Error) | Right(2)
  .map(plus2) // Left(Error) | Right(4)
  .map(plus3) // Left(Error) | Right(7)

// pre-processing funcs
const schema = () => "http://";
const addDomain = (schema: string) => schema + "wikipedia.com";

// function which could result in Error or 1
declare function getIntData(url: string): Either<Error, Int>;

// processing funcs
const plus1 = (input: number) => input + 1;
const plus2 = (input: number) => input + 2;

// chain with Either pattern
Either<Error, string>
  .right(schema())   // Left(Error) | Right("http://")
  .map(addDomain)    // Left(Error) | Right("http://wikipedia.com")
  .chain(getIntData) // Left(Error) | Right(1)
  .map(plus1)        // Left(Error) | Right(2)
  .map(plus2)        // Left(Error) | Right(4)
  .map(plus3);       // Left(Error) | Right(7)
  
const url = addDomain(schema());
const result = getIntData(url);
if(result){
  const finalResult = plus3(plus2(plus1(result)))
}else{
  const finalResult = result;
}
}

意味論:

「if(Right) apply function, else(Left) pass」という制御構造の追加

モナドとの関係

Eitherはしばしば「Eitherモナド」と呼ばれるように、モナド型（Monadic Types）の一種である。

temp

ペアトレード

ペアトレード（英: pairs trade）は金融取引戦略の一種で、相関する金融商品ペアのうち一方を買い他方を売る戦略である。

ペアトレードでは相関を持つ2つの金融商品に着目する。常に相関していた2つの商品間にある時点で乖離が発生したとき、過去の相関履歴から近いうちに2商品間の乖離（歪み）は収束すると仮定できる。乖離時に高値になった方の商品を売り安値になった方の商品を買うことで、近い将来に乖離が収束した際、売った商品は値が下がり買った商品は上がると期待できる。2つの商品を売り買いしているのでマーケットニュートラルになっており、ペアトレードをおこなうことは商品ペアの価格差を売買していることに相当する。

ペアトレードは統計的裁定取引の一種に分類される。</ref>。

記事化済み

• データ競合
• WebXR Device API
• 前庭皮質
• サービスディスカバリ
• Qニューロン
• アルゴリズム遅延

templates

genetically encoded voltage indicator

Thomas S. Otis

比喩

モナドが持つ性質・可能にする事象を説明するために、モナドがもつ特定の側面に注目した比喩がしばしば用いられる。

プログラム可能なセミコロン

「プログラム可能なセミコロン」はモナドがもたらす「処理と処理とつなぎ、繋ぎ部分で更なる処理をおこなう」側面に着目した比喩である。

処理のまとまりを文とした場合、処理A→処理Bの流れは多くのプログラミング言語で

const input = 1;
const resultA = processA(input);
const resultB = processB(resultA);

のように書かれる。処理Aと処理Bを区切り、かつ繋いでいるのは文末のセミコロンである。セミコロンの役割はあくまで区切りであり、セミコロンはresultAを変更したりはしない。 モナドを利用して処理A→処理Bを記述すると

1 >>=
processA >>=
processB

のように書かれる。文末のbind関数（>>=）はセミコロンのように文を区切っている。同時にbind関数はprocessAの出力 （resultA相当）をprocessBの引数とする役割も果たしている。bind関数はさらに、resultAがprocessBへ渡される前に暗示的な処理をおこなうことができる。処理の内容はモナド型に依存する。すなわち見た目上はセミコロンと同じ処理（文）の区切りだが、モナド型の設計によって文間での追加処理をプログラム可能となっている。ゆえに「プログラム可能なセミコロン」という比喩が用いられる。

フレーム (線形代数学)

冗長性を持った基底、のようなもの。

基底: 空間を張る、線形独立なベクトルの集合

歴史

1952年には発見されていたが、wavelet解析が現れる近年まであまり注目を受けてこなかった.

signal expansion (信号展開) に冗長性を持たせるアイデア自体は広く見られる.

種類

• Mercedes-Benz frame (the simplest harmonic tight frame)

• Tight frames
• Equal-norm frames
• Unit-norm frames
• NSGF (非定常ガボールフレーム)
  • 制約: frame atomsがコンパクトサポートを持ち (時間/周波数帯域が局在)、…
    • sufficiently dense frequency sampling points (フレームの時間シフトが、フレームの周波数領域でのsupport (関数の台) 幅で充分に小さく制約)
  • 性質: frame operator Sが対角行列になり、計算が (容易に) 可能
  • Frequency-Adaptive
    • Constant-Q 非定常ガボール変換 (CQ-NSGT): frame atomsの周波数解像度をConstant Qで制約
      • 原論文 (CQ-NSGT)
      • 分割と和による高速実装 (sliCQ): A framework for invertible, real-time constant-Q transforms
  • Time-Adaptive

具体的な種類

• Gabor frames : 複素変調が関わるフレーム
  • Gabor frame (oversampled DFT frame)
  • 何か（色々な別名）
    • oversampled DFT filter banks
    • complex-modulated filter banks
    • shorttime Fourier filter banks
    • Gabor filter banks
• cosine-modulated frames

表現変換 （基底変換を含む）のモチベーション: より「良い」表現

正規直交基底が良い表現とは限らない (e.g. 斜めに分布する何か)

> No one seems to know why they are called frames, perhaps because of the bounds in (3.8)

> It is generally acknowledged2 that frames were born in 1952 in the work of Duffin and Schaeffer [78]

> At least in the signal processing and harmonic analysis communities

ある空間を張る要素のこと。  

フレームである ⇒ 空間を張る  

は真だけど、逆は必ずしも真ではない  

# 出発点: 基底

空間を張る、線形独立なベクトル (のset) を基底という.  

しかして、線形独立という制限を取っ払うとどうなるのか？  

つまり、空間を張る要素 (atom) のsetには何か特徴が発生するのだろうか？  

まず、基底へと還元してatom数を減らすことは可能である。  

しかしてatomを維持する場合は、係数が複数パターン取れることがわかる。  

一種のリダンダンシーが発生してるとみることもできる。  

frame conditionを満たしたらatomのsetはframeといえる  

# 名前いろいろ

frame Φ : set of

dual frame ^~Φ

canonical dual frame

frame atom φ_i

analysis or decomposition

synthesis or reconstruction

operators

• frame operator S
• analysis operator Φ^*
• Grammian (Gramian) G

frame: frame conditionを満たすベクトルの集合  

analysis operator **T**: 任意のベクトルxを構成するframeの係数を求める演算子  

synthesis operator **T^***:

analysis operator: 任意のベクトルとatomの内積をとるだけ  

# フレームの特性

自然に双対フレーム (dual frame) が現れる.  

# 特別なフレーム

## タイトフレーム / tight frame

optimal lower frame boundとoptimal upper frame boundが同じ場合、tight frameと呼ばれる

# さらなる拡張

Bessel Sequenceはframe conditionのうちupper boundのみ満たすもの.  

# フォーマルかつ端的に言うと

内積空間においてframe条件を満たすベクトルの集合は「frame」と定義される。  

frame条件は、任意のベクトルとframeの各要素ベクトルの内積が、任意ベクトルの有限倍 (>0) になっていることである。  

frameは空間を張り、その要素は必ずしも線形独立ではない。張る際の係数は複数通りありうる。つまり過完備 (overcomplete) になる場合がある。  

参考文献

Jelena Kovaˇcevi´c and Amina Chebira. An Introduction to Frames

基底 (線型代数学)

完備性

フィルタ

フィルタ (信号処理)

時間領域での操作は周波数領域に影響を与える（基底変換みたいなものなので当然)

窓関数を時間領域でかける

周波数領域で考えると何が起きるかわかる (窓の掛算はフーリエ空間での畳み込み)

各点での値が広がってそれを重ね合わせる形になるhttp://www.ic.is.tohoku.ac.jp/~swk/lecture/yaruodsp/win.html

鍵になるのは線形時不変システムの周波数応答の考え方だ http://www.ic.is.tohoku.ac.jp/~swk/lecture/yaruodsp/dfbasic.html

周波数選択フィルタ

有限インパルス応答

周波数応答、周波数特性

時間周波数解析のために窓関数で時間を切ると何が起きるのか

a time-shift: atomを時間方向にずらす行列

atomの形自体で周波数帯域を決めて、k依存のtime-shiftで周波数ごとにちがうtime-binを実現？

時間シフトがフーリエ空間で周波数シフトっぽくなっているが、ここがよくわからない

CAGプロモーター

CAGプロモーターとは、高い発現量を目的として人工的に作られたキメラプロモーターである。

CMVエンハンサー、ニワトリβ-actinプロモーター、ウサギβ-グロビンPolyA signalを融合したプロモーターである。

哺乳類における遺伝子強制発現実験に広く用いいられるが、ゼブラフィッシュでは発現量の弱さが指摘されている。

あ

相分離 / phase separation

> 相分離とは相転移現象の一つで，混合系の温度・圧力などを変えることで相溶性が変化し，一相状態から二相状態に変化することをいう．

混合系, 相が変化して複相に

2相状態: 分離した水と油 (水相と油相)

液液の2相状態もある。

タンパク質も相分離を起こす.

金属

http://www.bureau.tohoku.ac.jp/manabi/manabi47/mm47-1.html

細胞内でおきる相分離 / biological phase transition

細胞内はタンパク質が均一に分散した溶液ではなく、hetero. phaseが複数あるともいえる.

つまり細胞内で液-液相分離 (タンパク質混合系における液-液相分離)が起きていると示唆され、近年再注目されている。

物性物理学と分子生物学をつなぐ可能性.

局在、コンパートメントに関わるあらゆる議論を巻き込みうる

局在/compartment

由来と維持

• 局所生成
• アンカー
• 輸送

形

• membrane organelles

• centrosome

• processing bodies (P bodies)
• 核小体 nucleolus

• nephrin intracellular domain (NICD)
• the interaction of arginine/glycine-rich RNA-binding proteins with RNA
• PAR or polyADP-ribose
  • transcription is required for the assembly of the nucleolus
• reconstituted pericentriolar material can drive microtubule formation

T-cell receptor, which can organize into membrane-associated phaseseparated clusters. Reconstitution experiments revealed that these clusters promote the recruitment of specifi c sets of signaling proteins. Importantly, the clusters were enriched for kinases but excluded phosphatases. Thus, phase separation could be an effective way to amplify signals and perform simple forms of computation.

transcription and splicing, suggesting that phase separation could be used to regulate these processes. Indeed, heterochromatin has recently been shown to be a phase-separated compartment.

phase-separated liquid droplets　https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S009286741830504X?via%3Dihub

Biomolecular condensatesを生む仕組み

condensates, granules

protein-protein, protein-nucleic acid interaction (physical framework)

role for strong, stereospecific interactions

very weak interactions

affinity, solubility, charge

linker配列とか対象になりうる

天然変性タンパク質 intrinsically disordered proteins

プリオンlike

nucleation & crystalization

Mike Rosen 2012

a critical threshold for phase separation

critical concentrations

fl uctuations in cytosolic pH promote widespread condensate formation during stress.

gel formation by the RNA-binding protein Pab1 has been proposed to regulate the availability of certain stressprotective RNAs.

分画に対する説明

コロイド

細胞はコロイド: 19th, Edmund Wilson

> 1899年、米国の細胞生物学者Edmund Beecher Wilson は、細胞の大部分を占める細胞質には、「『液体の混合物』 が含まれており、さまざまな化学的性質を持つ液滴が浮 遊している」と予想した2 。

コアセルベート

simple coacervation: phase separation of a single protein

complex coacervation: sp of two or more proteins

Alexander Oparinのコアセルベート

biomolecular condensates

巨大複合体との関係性を記述したいところ

生まれるphase

• ゲル
• ゾル
• glass
• crystal
• hydrogel

collective properties of biological macromolecules

Macromolecules are enriched or depleted in certain areas of the Primer cytoplasm and the distribution of these macromolecules is subject to constant change

Here, a homogenous solution of molecules spontaneously separates (‘demixes’) into two coexisting liquid phases, a dense phase that is enriched for these molecules and a phase that is depleted. The interface of these dense droplets forms a boundary that allows the selective passage of some molecules but not others.

コロイド化学: The science of macromolecular collectives

membrane less compartmentsをつくるdriverとしての液液相分離

thermodynamic equilibrium process

準安定状態

continuum model of phase separation.

energy-consuming enzymes

集団としての性質: H2Oのwetness, condencatesそのものの硬さ

refs

Simon Alberti. 2017. "Phase separation in biology" 10.1016/j.cub.2017.08.069

Elie Dolgin. 2018. "細胞内の「相分離」に注目" 10.1038/ndigest.2018.180624

space clamp

電気生理学におけるspace clamp問題.

News & Views 入門に良い

10.1152/jn.01232.2007

論文s

deep learning and EEG

"Deep learning with convolutional neural networks for EEG decoding and visualization"　https://doi.org/10.1002/hbm.23730

いろいろなCNNアーキテクチャをEEGに適応して性能を評価。CNNの良さは"end-to-end learning"(特徴抽出までをもCNNに機械学習させること)にある。"imagined"あるいは"executed" 時のEEGデータをデコードするタスクをおこなった。良く使われる"filter bank common spatial patterns"に劣らない成績を収めた。"end-to-end"なのでどんな特徴量をとってくるかはCNN次第だが、解析の結果としてはfrequency bandを利用している傾向がみられたみたい。

cortical features of locomotion-mode transition, EEG

"Cortical Features of Locomotion-Mode Transitions via Non-invasive EEG"

locomotionのmodeが変わるときにEEGがどう変化するか、を調べた論文。独立成分分析とk-means(k平均法)をして、locomotion時に4つ脳領域が関与すると判明。後頭葉のspectral powerが"level-ground"と"stair"で違うことがわかり、この遷移が実際の遷移に1.5秒先立って起きることも検出できた。

チロシナーゼ

チロシナーゼは、チロシンをメラニン色素に変換する酵素.

ゼブラフィッシュ

tyrosinase (tyr)遺伝子がコードしている。スプライシングバリアントは存在しない。5exonで構成され、mRNAは2048bp, タンパクは534AA。いくつかのパラログがある。

参考文献

"Tyrosinase gene expression in zebrafish embryos"

ZFIN, tyr

2Aペプチド

2Aペプチドとはリボソームスキッピングを引き起こすアミノ酸配列のこと。ピコルナウイルス科 口蹄疫ウイルス由来で最初に発見された. 1つの伝令RNAから2つ以上の分離したタンパク質を翻訳 (生物学)させる仕組みとして、遺伝子工学に用いられる。

商用ベクター

T2A (Thosea asigna 2A peptide) 利用例

種類

• T2A: Thoseaasigna virus
• P2A: porcine teschovirus-1 （ピコルナウイルス科)
• E2A: rhinitis A virus (ERAV)
• F2A: foot-and-mouth disease virus: FMDV (口蹄疫ウイルス)

4種の効率比較 (in HET293T, HT1080, HeLa, zebrafish embryo(mRNA injection), mouse liver(adeno virus))

"Quantitative comparison of gene co-expression in a bicistronic vector harboring IRES or coding sequence of porcine teschovirus 2A peptide"

multi-cistronic vectorで順番が大事か否か "Systematic comparison of 2A peptides for cloning multi-genes in a polycistronic vector"

IRESとの比較 "Quantitative comparison of gene co-expression in a bicistronic vector harboring IRES or coding sequence of porcine teschovirus 2A peptide"

参考文献

Plasmids 101: Multicistronic Vectors

2A peptide

ぽりしすとろん

石英ガラスセル/キュベット

https://www.jasco.co.jp/jpn/inquiry/faq.html

https://www.gelifesciences.co.jp/technologies/spectro/spectclub/master_01.html

http://www.photosynthesis.jp/proto/bunkou.html

https://www.gelifesciences.co.jp/technologies/spectro/spectclub/master_04.html

Tol2トランスポゾン

Tol2トランスポゾン(transposon, transposable elements)とは、メダカのゲノムに内在するトランスポゾンの一種である。

Kawakami (1998)要チェック.

プラスミド

T2KXIG: Xenopus EF1α enhancer/promoter, rbbit b-globin intron, EGFP, SV40 polyA signal.

T2Ksix3.2G: six3.2 promoter, EGFP, SV40 polyA signal.

T2KSAG:

Kwakami (2000):

mini-Tol2: T2KXIGΔin, T2AL200R200G, T2AL200R150Gなど、Tol2の配列を削ったもの

発見と開発の歴史

Koga, et al.. (1995): Tol1の発見、トランスポゾンとしての可能性示唆

Koga, et al.. (1996): Tol2の発見

Kawakami, et al.. (1998): Tol2がautonomousであることの証明. ゼブラフィッシュでのTol2活性の証明

Kawakami & Shima. (1999): Tol2 transposaseの同定と、ゼブラフィッシュでのmRNA injectionによるnon-autonomousな活性の証明

Koga & Hori. (1999): Tol2は似てる

Kawakami, et al.. (2000): Tol2のトランスポゾンとしての活性を詳細に評価

Kawakami, et al.. (2004): Gene Trap法とTol2:specific-promoterの実証

Darius, et al.. (2006): minimal Tol2 elementの同定 (miniTol2 [L261R202])

Urasaki, et al.. (2006): minimal Tol2 elementの同定 (L200R150)

飽和突然変異誘発

飽和突然変異誘発 (saturation mutagenesis) とは、遺伝子の突然変異を考えられる全ての組み合わせで誘発することである。

タンパク質工学では「アミノ酸配列の特定部位で全バリアントを作製する」ことになる。タンパク質の機能解析においても有用である。

四肢・鰭の発生

東北大学 田村研究室

keyword spotting

keyword spotting (KWS)とは「事前に設定されたキーワードを発話から検出すること」である。

概要

機械に話しかけてスイッチを入れる仕組み、例えば Appleの"Hey Siri"、Googleの"OK Google" や Amazonの"Alexa" はkeyword spotting (KWS)である。

これらの仕組みでは、常に音声入力を見張ってキーワードが出現しないか検証する必要があるため、多くの計算資源を消費する。ゆえにスマートフォンやIoT端末のような処理性能の高くない機器で利用するためには、クラウドでの処理あるいは計算資源を消費しづらい (small-footprintな) 設計をすることが必要である。

手法

KWSには様々な手法が存在する。

• LVCSSR-based KWS: LVCSR(大語彙連続音声認識)=>テキスト比較
• Phonetic Search KWS: 連続音素認識でコード=>音素列による比較
• Acoustic KWS: KWモデル・背景モデル、遷移管理 (非テキスト変換)
• Deep KWS: NN (非テキスト変換)

ライブラリ・サービス・プラットフォーム

• KWS特化
  • Snowboy: 音声をアップロードすると学習が行われ、それを利用してKWSをローカルで実行できるライブラリ
    • VADでフィルターしてからKWSの模様
• 音声認識一般
  • 音声認識 (Speech to Text) + テキスト検索

重要用語

detection accuracy: 検出精度

false alarm (FA) rate:

small footprint:

関連用語

hotword

wake word/ wakeword detection

論文

title	year	author	content	FRR:FA	architecture	link
Small-footprint keyword spotting using deep neural networks	2014/5	Guoguo Chen	前処理と単純なNNで既存法より出来た
Low Resource Keyword Spotting	2014/12	Guoguo Chen	既存法のまとめとpreliminary experiments
Model Shrinking for Embedded Keyword Spotting	2015	Ming Sun	既存法を低リソースで (前処理+SVM)
Online Keyword Spotting with a Character-Level Recurrent Neural Network	2015	Kyuyeon Hwang	RNN
Query-by-example keyword spotting using long short-term memory networks	2015	Guoguo Chen	LSTM-RNN, ノイズに弱い？
Small-footprint high-performance deep neural network-based speech recognition using split-VQ	2015	Yongqiang Wang	すごい低resource!!
A fixed-point neural network for keyword detection on resource constrained hardware	2015	Mohit Shah	低resource細かく解析
An Early Resource Characterization of Deep Learning on Wearables, Smartphones and Internet-of-Things Devices	2015	Nicholas D. Lane	実機(edisonとか)でのresource消費
Automatic gain control and multi-style training for robust small-footprint keyword spotting with deep neural networks	2015	Rohit Prabhavalkar	オートゲインで良くなったよ
Convolutional neural networks for small-footprint keyword spotting	2015	Tara N. Sainath	CNN
An End-to-End Architecture for Keyword Spotting and Voice Activity Detection	2016	Christopher T. Lengerich	voice activity detectionを同時にできる？
Investigation of DNN-Based Keyword Spotting in Low Resource Environments	2016	Kaixiang Shen	少ないサンプル数
Convolutional Recurrent Neural Networks for Small-Footprint Keyword Spotting	2017	Sercan Ömer Arik,	Convolutional Recurrent NN		PCEN-mel + CRNN

"Convolutional Recurrent Neural Networks for Small-Footprint Keyword Spotting"

data

• keyword: "TalkType" (can be pronouced as a single word or two words)

• data set: ~16k different samples, collected from more than 5k speakers
  • training:development:test = 6:1:1

flow

process of single frame

 process :                mel-filterbank                       PCEN
   data  :    raw_data   ================>  mel-spectrogram  ========>  PCEN-mel-spectrogram  =>             CNN               =======> RNN ===> 
dimension:   1 * 24,000                         40 * 151                       40 * 151          Nc:32 filter(20,5) shift(8,2)
 software:                   librosa                                                                      NNabla

sound acquisition

• frame length: T = 1.5 seconds

• sampling rate: 16 kHz

frontend

PCEN mel spectrogram

rawData[time-domain] => 40 x 151 (40 channel x {1500 msec/10 ms stride})

mel spectrogram library: https://librosa.github.io/librosa/generated/librosa.feature.melspectrogram.html

NN layer

CNN => RNN => fully-connected => Softmax

RNN: bi-directional RNN LSTM or GRU GRU https://en.m.wikipedia.org/wiki/Gated_recurrent_unit

https://arxiv.org/pdf/1409.1259.pdf

BRNN: https://en.m.wikipedia.org/wiki/Bidirectional_recurrent_neural_networks

http://ieeexplore.ieee.org/document/650093/?tp=&arnumber=650093&url=http:%2F%2Fieeexplore.ieee.org%2Fiel4%2F78%2F14188%2F00650093.pdf%3Farnumber%3D650093

PCEN

PCEN (Per-Channel Energy Normalization) は2016年に提唱された音声認識のfrontend手法。DNN-based acoustic modelingで従来用いられていた"log-mel frontend"の代替として"PCEN frontend"が提唱された.

これらの手法では生の音源データを

"log-mel frontend": rawData => FTT => melフィルタバンク => log圧縮

"PCEN": rawData => FFT => melフィルタバンク => AGC(自動利得制御) => log圧縮

log圧縮でダイナミックレンジは小さくなるけど、問題が3つ

• x = 0 に特異点
• low level (情報が少ない領域) を引き延ばす => 無駄
• 音量を考慮とかはできない == 音量が違ったら異なるfeatureが出てくる

静的なlog圧縮を置き換えるのがPCEN。好きなフィルタバンクで分割した後、各々にPCENを適用する形。これがfeed-forward自動利得制御(Automatic Gain Control, AGC)として働くみたい。一次の有限インパルスフィルタをかけたもので、もとのを割ってる。

ケプストラム

メル尺度: 音高の知覚尺度。人が感じる音の高低に基づいた尺度。Hzと知覚音階は正比例しないから、それを補正した感じ？melodyのmel.

とても良い文献　http://abcpedia.acoustics.jp/acoustic_feature_2.pdf

その２　https://www.slideshare.net/tyoshioka/2015-51047277

$PCEN(t,f)=\color {blue}({\color {red}{\frac {E(t,f)}{(\epsilon +M(t,f))^{\alpha }}}}+\delta )^{r}-\delta ^{r}$

red: feed-forward AGC, blue: stabilized root compression to further reduce the dynamic range

t:timeIndex, f:frequencyIndex, E(f,t): filterbank Energy, ε: constant to prevent divison by 0

M(t,f): smoothed version of E(t,f)

α: gain normalization strength parameter

$M(t,f)=(1-s)M(t-1,f)+sE(t,f)$

s: smoothing coefficient

following AGC, stabilized root compression

δ: offset, r: exponent

if s==0.5 then M(t,f) = 0.5M(t-1,f) + 0.5 E(t,f)

= 0.5(0.5 M(t-2, f) + 0.5 E(t-1,f)) + 0.5 E(t,f)

一般化

if s==s then

M(t,f) = (1-s) M(t-1,f) + s E(t,f)

. = (1-s) {(1-s) M(t-2,f) + s E(t-1,f)} + s E(t,f)

. = (1-s)^2 M(t-2,f) + (1-s)s E(t-1,f) + s E(t,f)

. = (1-s)^k M(t-k, f) + Σ {s * (1-s)^(j-1) * E(t-j, f)}

M(-x, f)が録音前と解釈すればM(-x,f) = 0なので

M(t,f) = Σ {s * (1-s)^(j-1) * E(t-j, f)}

lim k->∞ s * Σ(1-s)^kは1らしい。つまりE(t-k, f)を加重平均(最新が重く古いものが軽い)していることになる。指数移動平均に該当。

miRNA

let-7

> let-7はC.elegansで発見された、最初のmiRNAのひとつ

> http://www.3d-gene.com/case/application/app_007.html

> ヒトでは図1に示すように極めて配列相同性が高い複数のファミリー遺伝子があります1)。

> 1) Science 294 (5543): 853-858. 2001

> http://www.3d-gene.com/case/application/app_007.html

pri-miRNA転写の制御

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3019299/

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5215532/

https://academic.oup.com/nar/article/42/7/4640/2435588/Interplay-between-pre-mRNA-splicing-and-microRNA

ヘテロシナプス可塑性

ヘテロシナプス可塑性 (異シナプス可塑性) とは、入力を直接受けていないシナプスにおける可塑性である。

刺激を受け取ったシナプス (ホモシナプス) では伝達効率が可塑的に変化する。その際、直接刺激を受容したわけではない周辺のシナプス (ヘテロシナプス) でも伝達効率の可塑的変化が見られる。これがヘテロシナプス可塑性である。

Heterosynaptic Plasticity: Multiple Mechanisms and Multiple Roles

heterosynaptic LTD

in the hippocampus, with homosynaptic LTP (Lynch and others 1977)

Heterosynaptic LTP (Bonhoeffer and others 1989; Engert and Bonhoeffer 1997; Kossel and others 1990; Schuman and Madison 1994)

> The direction of plastic changes was correlated with initial paired-pulse ratio, which is inversely related to the release probability

Ca2+が当然のように最有力候補だが、それだとheterosynaptic plasticityが両方向に行く説明がつかない.それに近傍の別細胞での可塑性も簡単には説明がつかない.

> However, the final outcome, LTP or LTD, might be also strongly influenced by predispositions of synapses for plasticity, because both potentiation and depression could be induced at synapses presumably located at similar distances and thus experiencing similar calcium rises (Lee and others 2012).

グリアと脱分極

脱分極の発生

Voltage-dependent calcium channels in glial cells (1984)

glialが活動電位 (Ba2+ spike) を起こすと証明した最初の論文.

他のチャネルに隠れて見えてなかった模様.要評価.

パッチするためにcAMPで膨らますというちょっとtrickyなこともしてる.

チャネルブロッカー (Mn, TMA, TTXありあり) + カルシウム電流強調のためのBa2+で初めて見えた。

Ca2+ activated K+で戻っちゃうとかが見えてなかった理由?

Swelling of Astrocytes Causes Membrane Potential Depolarization (1988)

swellingという生理学的変化自体が膜電位を変え得る、という報告。膜電位の変化がアストロサイトの変化を生み得るなら、swellingが様々な病理変化の原因となりうる.

K+ spatial bufferで脱分極することはとても良く知られている.

"Imaging calcium microdomains within entire astrocyte territories and endfeet with GCaMPs expressed using adeno-associated viruses"

電気的に不活性だよという図が載ってる

Mathieu Letellier et al.. (2016.5) "Astrocytes regulate heterogeneity of presynaptic strengths in hippocampal networks"

> it has been proposed that distinct inputs cooperate by coordinating their relative strengths through heterosynaptic interactions (7⇓–9)

> Schaffer collateral–CA1 synapses, tetanic stimulation that induces LTP is often accompanied by presynaptic long-term depression (LTD) of nonstimulated Schaffer collateral–CA1 synapses (11, 13, 14).

回路全体の (グローバルな) 活動強度を調節する仕組み

低頻度刺激 (1Hz, 3min)でシナプス強度変化を誘起

刺激したシナプス (homo-synapses) でも増強/減弱ともに発生.

PPRとCV−2を評価したら、EPSP変化と指標が逆相関したので、pre-synapseの関与が示唆された.

VGLUT-pHluorinでも確かめられたので、preはからんでる

このとき非刺激シナプス (hetero-synapse)でも増強/減弱が見られる.

でもこれはhomo-synapseでの可塑性方向ととくに相関がみられない

disparity of presynaptic strengths between inputs

入力間での、前シナプス強度のばらつき

PPR difference between the two inputs (the PPR disparity)

paired-pulse ratio:

2発目/1発目

刺激の時間差はどんなもの？

前後で影響ないなら1になって当然

PPR > 1: 短期で二発目のほうがたくさん情報 (EPSP) を伝達できる

放出確率 (pが大きくなったら枯渇しやすくなるので1を切る)

脱分極の結果、脱分極との相関

K+ depolarization evokes ATP, adenosine and glutamate release from glia in rat hippocampus: a microelectrode biosensor study (2012)

On the Role of Voltage-Dependent Calcium Channels in Calcium Signaling of Astrocytes In Situ

in vivoではどうなの、っていう論文.

Ca2+ channel antagonist verapamilでex vivoの[Ca2+]iが減るという報告は複数ある. しかしVGCC電流の報告は出てきてない.

glia-conditional && temporally-conditional にしたらKDできるんだよなぁ

cultureでやってみるか？

アストロサイトとK+

Astrocytic modulation of neuronal excitability through K+ spatial buffering (2017) review　未読

"The potassium channel KCa3.1 constitutes a pharmacological target for neuroinflammation associated with ischemia/reperfusion stroke"

"Distribution of rSlo Ca2+ -activated K+ channels in rat astrocyte perivascular endfeet"

KCaチャネルの局在が載ってる

intracellular BKCa channels

なんか面白そう

small conductance calcium-activated potassium channels in rat brain

subcellular localization of K+ channels in mammalian brain neurons remarkable precision in the midst of extraordinary complexity

molecular and cellular basis of small and intermediate conductance, calcium activated potassium channel function in the brain

アストロサイトとCa2+

Ca21 Transients in Astrocyte Fine Processes Occur Via Ca21 Influx in the Adult Mouse Hippocampus

VGCC

VGCCとアストロサイト

"PKCε upregulates voltage‐dependent calcium channels in cultured astrocytes"

"グリア細胞の性質と機能"

"Appearance of fast astrocytic component in voltage-sensitive dye imaging of neural activity"

"Circuit-specific signaling in astrocyte-neuron networks in basal ganglia pathways"

"Ca2+ signaling in astrocytes from IP3R2−/− mice in brain slices and during startle responses in vivo"

https://www.addgene.org/50473/

"Electrophysiological and molecular evidence of L‐(Cav1), N‐ (Cav2.2), and R‐ (Cav2.3) type Ca2+ channels in rat cortical astrocytes"

Glia (2004)

Astrocyte pure cultureでの電気生理学, 分子生物学をメインとした実験. 各種チャネルの発現と機能を立証。これは偉大な論文.

cultured rat cortical astrocytes, シェイク方式でpure培養

全引用確認

文献リスト:

"Regulation and the Mechanism of Estrogen on Cav1.2 Gene in Rat-Cultured Cortical Astrocytes"https://link.springer.com/article/10.1007%2Fs12031-016-0803-y

"Astrocytes regulate heterogeneity of presynaptic strengths in hippocampal networks"http://www.pnas.org/content/113/19/E2685

"Activation of Phosphatidylinositol-linked Novel D1Dopamine Receptor Contributes to the Calcium Mobilization in Cultured Rat Prefrontal Cortical Astrocytes"https://link.springer.com/article/10.1007%2Fs10571-008-9323-9

"Glutamate receptor activation triggers a calcium-dependent and SNARE protein-dependent release of the gliotransmitter D-serine"http://www.pnas.org/content/102/15/5606

"Expression of T-type calcium channel splice variants in human glioma."https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15378657

◎ "Ultrastructural evidence for pre- and postsynaptic localization of Cav1.2 L-type Ca2+ channels in the rat hippocampus."https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/cne.21567

rat海馬の免疫電顕でCav1.2の局在確認。明確にグリア (アストロlike) で発現が認められる。いいreferenceもありそう。

"Role of n‐type voltage‐dependent calcium channels in autoimmune optic neuritis*"https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/ana.21668

"L-type calcium channel CaV 1.2 in transgenic mice overexpressing human AbetaPP751 with the London (V717I) and Swedish (K670M/N671L) mutations."https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20413896

"Nuclear localization of Cav2.2 and its distribution in the mouse central nervous system, and changes in the hippocampus during and after pilocarpine‐induced status epilepticus"https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1111/j.1365-2990.2009.01044.x

"Ca(2+) sources for the exocytotic release of glutamate from astrocytes."https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21118669

Modeling the spontaneous Ca2+ oscillations in astrocytes: Inconsistencies and usefulness"https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22262535

"Ca2+ transients in astrocyte fine processes occur via Ca2+ influx in the adult mouse hippocampus."https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27479868

Modeling the spontaneous Ca2+ oscillations in astrocytes: Inconsistencies and usefulness.

"L-Type Voltage-Operated Calcium Channels Contribute to Astrocyte Activation In Vitro"

Glia (2016)

"Simulation of Spontaneous Ca2+ Oscillations in Astrocytes Mediated by Voltage-Gated Calcium Channels"

カルシウムウェーブをシミュレーションしてみた

"Modulation ++ of Intracellular Ca in Cultured Astrocytes by Influx Through Voltage-Activated Ca+ + Channels"

ab系

"CaV1.2 calcium channel expression in reactive astrocytes is associated with the formation of amyloid-β plaques in an Alzheimer's disease mouse model."https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23948887

"Short- and long-term treatment of mouse cortical primary astrocytes with β-amyloid differentially regulates the mRNA expression of L-type calcium channels."https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24435206

L型電位依存性カルシウムチャネル

LはLong-lasting-inactivationとLarge-conductance.

> 遅い不活性化 (Long lasting) と大きな (Large) 単一チャネルコンダクタンスを有することから名づけられた

> https://bsd.neuroinf.jp/wiki/電位依存性カルシウムチャネル

> 高電位活性化型(High-Voltage Activated, HVA)のVDCCは、α₁、α₂δ、βおよびγサブユニットから成るヘテロ4量体を形成すると考えられている

> https://bsd.neuroinf.jp/wiki/電位依存性カルシウムチャネル

a1はCaV1.1, 1.2, 1.3, 1.4がある

Cav1.2が心臓

> Ca_v1.2は心臓や脳

> https://bsd.neuroinf.jp/wiki/電位依存性カルシウムチャネル

> 大きな細胞外領域を有するα₂δサブユニットは、単一の遺伝子にコードされるα₂およびδがジスルフィド結合によって結ばれた二量体で、4種類のアイソフォームが知られる (α₂δ1-4)。

> https://bsd.neuroinf.jp/wiki/電位依存性カルシウムチャネル

> βサブユニットは、4種類のアイソフォームが知られている (β1-4)。

> https://bsd.neuroinf.jp/wiki/電位依存性カルシウムチャネル

> 　Ca_v1.2遺伝子 (CACNA1C) は、心臓のQT延長や、合指、自閉症といった症状を示すTimothy症候群の原因遺伝子である。

> https://bsd.neuroinf.jp/wiki/電位依存性カルシウムチャネル

総説

> https://www.jstage.jst.go.jp/article/fpj/144/5/144_211/_pdf

Cdk5とL-type VDCC

細胞の状態で影響が変わる

> http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/jnc.12746/abstract;jsessionid=09AA700B8FF0A9A900BE8AC24358DFBC.f03t04

https://waseda.pure.elsevier.com/en/publications/cdk5-dependent-regulation-of-glucose-stimulated-insulin-secretion

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2213671117302357

> The coIP results demonstrated a binding of CDK5 with CaV1.2 

結局この論文では、最終的なリン酸化ポイントは確定せず.

細胞状況に強く依存することを考慮すると、vitroのassayが役に立ちづらそう

L-type VDCCの制御ポイント

アストロサイトマーカー

• GFAP

• EAAT1/GLAST (GLutamate-ASparate Transporter)
• EAAT2/GTL-1
• Glutamine synthetase
• S100 beta
• ALDH1L1

[ref](http://www.abcam.co.jp/neuroscience/astrocyte-markers-and-functions-2)

elavl3

ZFIN: https://zfin.org/ZDB-GENE-980526-76

ゼブラフィッシュにおけるヒトHuCホモログの発見と発現解析(1996).

HuC以外のゼブラフィッシュHuホモログ https://zfin.org/ZDB-PUB-000125-9

review

M. N. Hinman & H. Loua. "Diverse molecular functions of Hu proteins". Cell. Mol. Life Sci. 65 (2008) 3168 – 3181 1420-682X/08/203168-14

https://doi.org/10.1007/s00018-008-8252-6

神経発生異常のスクリーニングマーカーとしてin situ hybrydizationに使われてたり (Artinger et al., 1999)

zebrafish HuC promoter engineering

Tomomi Sato, Mikako Takahoko, and Hitoshi Okamoto. "HuC:Kaede, a Useful Tool to Label Neural Morphologiesin Networks In Vivo". genesis.

> we con-structed a transgene HuC:Kaede to induce the expression of Kaede in neurons under the control of a modified version of the zebrafish HuC promoter (Higashijima et al., 2003).

Shin-ichi Higashijima, Mark A. Masino, Gail Mandel, Joseph R. Fetcho. "Imaging Neuronal Activity During Zebrafish Behavior With a Genetically Encoded Calcium Indicator".

Journal of Neurophysiology. 2003.

> For generating stable transgenic lines expressing cameleon in all neurons, a slightly modified version of the zebrafish HuC promoter was used (Park et al. 2000).

HuCプロモーター配列の活性部位を調べた偉大な論文.

Park et al. 2000. "Analysis of Upstream Elements in the HuC Promoter Leads to the Establishment of Transgenic Zebrafish with Fluorescent Neurons" https://doi.org/10.1006/dbio.2000.9898

> We have characterized the promoter of the zebrafish HuC gene by examining the ability of 5′-upstream fragments to drive expression of green fluorescent protein (GFP) in live embryos.

TATAボックスの存在しないプロモーター

> no TATA box is present near the transcription start site

転写開始点の同定

HuC cDNAの5'UTRをprimerとしたprimer extension

> The transcription start site was determined by primer extension using an antisense oligonucleotide derived from the 59-UTR sequence of HuC cDNA (Kim et al., 1996)

intronも大事かもしれない

> For stable expression of GFP in the neurons, a HuC-GFP minigene was constructed containing the 59-flanking region, exon-1, a part of exon-2, and the intervening intron-1 of HuC, and GFP coding sequence. The rationale for this was that intervening sequences have been suggested to increase gene expression in transgenic mice (Brinster et al., 1988) and zebrafish (Amsterdam et al., 1995).

> however, we cannot completely rule out the possibility that intron-1, inserted into the HuC-GFP minigene, might also provide additional elements required to mimic endogenous HuC expression

HuC line

https://zfin.org/ZDB-TGCONSTRCT-090115-4

https://zfin.org/ZDB-TGCONSTRCT-111028-2

https://zfin.org/ZDB-TGCONSTRCT-121024-4

https://zfin.org/ZDB-TGCONSTRCT-130208-4

https://zfin.org/ZDB-TGCONSTRCT-130919-1

https://zfin.org/ZDB-TGCONSTRCT-161116-2

+心筋

https://zfin.org/ZDB-TGCONSTRCT-120104-2

https://zfin.org/ZDB-TGCONSTRCT-120105-1

https://zfin.org/ZDB-TGCONSTRCT-120105-6

KalTA4

https://zfin.org/ZDB-TGCONSTRCT-151029-7

ここまでの参考文献

Cre line

https://zfin.org/ZDB-TGCONSTRCT-170607-1

脊髄発生

初期運命はforebrainで、シグナルによって後方化が進む.

> The prevalent model from studies in many vertebrates, including zebrafish, is that the most anterior CNS region, forebrain, is the default fate in the embryonic neural plate, and that signals are required to posteriorize the neural plate and thus specify more posterior CNS regions, including the spinal cord.

> http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0301008203000522?via%3Dihub

シグナルはFGF, Wnt, RA

neuromeres

配列はしているのにセグメント化していない脊髄

> In sharp contrast, the spinal cord remains unsegmented, although an anterior-posterior iterative arrangement of various neuronal populations can be seen to different degrees in Amphioxus, zebrafish and in certain tetrapods

> http://dev.biologists.org/content/develop/134/11/2147.full.pdf

進化的にhindbrainとspinal cordは同じ起源

> have a common evolutionary origin (Ghysen, 2003; Hirth et al., 2003).

• Cdx1
• Cdx2
• Cdx4

> we present evidence that spinal cord specification in zebrafish is dependent on the partially redundant functions of Cdx1a and Cdx4.

> we show that this expanded hindbrain is organized into segmental units arranged in a mirror-image duplicated pattern of ectopic rhombomeres within the trunk region of the embryo.

Cdxの関与

http://dev.biologists.org/content/develop/134/11/2147.full.pdf

RAの関与

http://dev.biologists.org/content/141/22/4375

progenitor domain

特定のタンパク質マーカーによる、神経前駆細胞の領域分け、のこと.

an idealized spinal cord

少なくとも13のdomain, 計23のsub-domainにわけられる. 動物種間で保存度が高い.

動物種

ゼブラでもpdドメインちゃんとある. マウスとほぼ同じdorsalパターン 。神経伝達物質もほぼ同じ

思ったところ

"脊椎動物/vertebrate"だから脊髄発生は強い共通性を持つ.という信念を発生学から感じる.あるいは私の想い.

ポイント: domainであってcellではない。domainはあくまで1つの区分け方.だと私は思う.

articles

S. Gllilnerが書いたreview. 進化に想いを馳せるには良い文献 “Measured Motion: Searching for Simplicity in Spinal Locomotor Networks”

dorsalに注目

"The dorsal spinal cord and hindbrain: From developmental mechanisms to functional circuits"

"A transcription factor network specifying inhibitory versus excitatory neurons in the dorsal spinal cord"

ventralより

"Moving the Shh Source over Time: What Impact on Neural Cell Diversification in the Developing Spinal Cord?"

total review

Nat. Rev. Neurosci. "Decoding the organization of spinal circuits that control locomotion", 10.1038/nrn.2016.9

参考文献

• 脳科学辞典 脊髄の発生

in vitro transcriptionとpoly-A tail

poly-A tailなしmRNAをinjectionしても、原理的にはpoly-A tailが付与されることはない.

しかし人工的なpoly-A tail付与をしても、zebrafsih eggへのmRNA injectionではmRNAの寿命に顕著な影響がなかった。

ありうる解釈としては、細胞質poly-A tail付加などがあるが、原因は不明。

poly-A tailとtermination(転写終結) について

SLiCE法

SLiCE法 (SLiCE cloning) とは、大腸菌 溶解液が持つ内在性の相同組換え活性をin vitroで用いて、制限酵素部位に依存せずPCR(ポリメラーゼ連鎖反応)断片をベクターへクローニングする方法である。いわゆる seamless cloning の一種。

概要

大腸菌のもつ内在性 相同組換え活性を利用し、PCR断片をクローニングする手法。

SLiCE (Seamless Ligation Cloning Extract) はHR活性をもった大腸菌 溶解液のことを指しており、SLiCEによるクローニングがSLiCE法 (SLiCE cloning) と呼ばれている模様。

初めて報告されたSLiCE法から改良がくわえられ、通常の研究室で使われる系統 (DH5aなど) から SLiCE が得られるようになっている。

改良したラボによると、PCRプライマーの到着から2日でcloningが終了する。

SLiCEとベクター断片を一度調製してしまえば、3ステップ (PCR, 反応液混合15分, トラホメ) でクローニングが可能。

改良の歴史

Triton X-100を使うやり方 .

類似の方法

• In-Fusion^® (In-Fusion HD Cloning). Takara(Clontech)
• GeneArt® Seamless Cloning & Assembly. Thermo Fisher Scientific (Life technologies)
• Gibson Assembly Master Mix. NEB
• NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix. NEB

設計ツール

In-Fusion https://www.takara-bio.co.jp/infusion_primer/infusion_primer_form.php

In-Fusion http://www.clontech.com/US/Products/Cloning_and_Competent_Cells/Cloning_Resources/Online_In-Fusion_Tools

GeneArt https://www.thermofisher.com/order/oligoDesigner/

NEBuilder http://nebuilder.neb.com/

まとめ記事 http://www.biocompare.com/Editorial-Articles/162406-Say-Goodbye-to-Genetic-Scars-with-These-Seamless-Cloning-Kits/

ASAP

ASAPは神経細胞の膜電位を可視化する、genetically encoded voltage indicatorの一種である。ASAPシリーズの総称。

概要

ASAP (Accelerated Sensor of Action Potentials) はgenetically encoded voltage indicatorの一種である。ASAP1をはじめとする、ASAPシリーズの総称を指す。神経細胞の電気的活動 (膜電位) を光で可視化する、膜電位イメージングに用いられる。スタンフォード大学のMichael Z Linらが主導して開発を進めており、2017年現在で世界最高峰のGEVIシリーズとされる。ニワトリ由来のGgVSDとcpGFPを結合した、VSFP型GEVIである。

特徴

構造

VSDのloop3とloop4の間にcpGFPが挿入されている。VSDはニワトリからとってきた (GgVSD .)。GFPはcpsfGFP-OPT。

膜電位感受メカニズム

• Vm sensing: タンパク質 立体構造変化.

• reporting: プロトン化による蛍光強度変化

GgVSDが電位変化を感受して立体構造変化を起こす結果、cpGFPも構造が変化する。おそらく、cpGFP蛍光団のプロトネーション状態が変わり、蛍光強度が変化する。脱分極で消光、過分極で強く蛍光する。

二光子励起

二光子励起による膜電位イメージングに成功している、数少ないGEVIである。Ace-mNeonなどのopsin型GEVIは二光子励起すると膜電位感受性を失う場合がある。ASAPは二光子励起による膜電位イメージングがすでに報告されている。

蛍光強度

議論なし…？

ASAPシリーズ

name	year	precursor	feature	HEK	culture	slice	in vivo	二光子励起	利用例
ASAP1	2014	ArcLight							1件
ASAP2f	2016	ASAP1(A147S ΔA148)		Figure S1	Figure S1	-	fly	〇 (元論文？)	なし
ASAP2s	2017	ASAP1(R415Q)	improved Vm sensitivity & slower off-rate					〇	-
ASAP3	unpublished						mouse?	〇	-

sensitivity

	HEK293	hESC-CM	cultured neuron	slice culture (2-photon)
ASAP1	-23.3	-24.0 (hESC), -16.8 (iPSC)	-8.6%/AP	-8.4%/AP
ASAP2f				same as ASAP1
ASAP2s	-38.7	-45.1 (hESC), -29.1 (iPSC)	-12.2%/AP	-15.0%/AP
ASAP3b

ASAP2s

ref.25要チェック？

off-rates: Table1. 100 Hz in single trial検出には十分

article story

• HEK293 1P sensitivity (Fig.1)
• HEK293 1P & 2P brightness & stability (Fig.1 supp)
• 1P CM & cultured neuron (Fig.2)
• 2P in vivo fly (Fig.3)
• 2P slice culture
  • can detect AP by single-trial (Fig.4)
  • can detect sub-threshold potential by single-trial (Fig.5)
  • detailed ASAP's kinetics (Fig.6)
  • detectability & scan-speed (Fig.7)
  • high frequency detection (Fig.8)
  • single voxel detection (Fig.9)
  • subcellular voltage (Fig.10)

1P spec. of ASAP2s

sample	sensitivity	single-trial trace
HEK293	-38.7%/100 mV (-70=>+30)	Figure 1—figure supplement 1J
CM	-45.1 (hESC)-29.1 (iPSC)	Figure 2B (hESC-CM) Figure 2—figure supplement 1B (iPSC-CM)
cultured neuron	-12.2%/AP	Figure 2—figure supplement 3A

2P spec. of ASAP2s

sample	sensitivity	single-trial trace
slice culture	-15.0%/AP	Figure 4 —figure supplement 2 Figure 9A Fig.4f
fly

figures

• 1-photon
  • Figure 1
    • Fig.1: in vitro (HEK293A), 1-photon. sensitivity & spectrum
    • Fig.1 sup.1: other variants.
      • J: response to artificial APs (4-ms FWHM, 100 mV peak, 100Hz 10 AP)
    • Fig.1 sup.2: 1P & 2P brightness ASAP1 vs 2s
    • Fig.1 sup.3: 1P bleaching
    • Fig.1 sup.4: 2P bleaching
    • Fig.2: in vitro (hESC cardiomyocytes & rat culture neurons)
  • Figure 2
    • A-F: hESC cardiomyocites
    • G-K: rat cultured neuron
    • Fig.2 sup.1: hESC-CM. 1P. single-trial response
    • Fig.2 sup.2: membrane localization ASAP1, 2s, Ace2N-2AA, 4AA
    • Fig.2 sup.3: cultured neuron. 1P. single-trial response & bleaching
• 2-photon
  • in vivo, fly
    • Figure 3
      • Fig.3: in vivo (fly), 2-photon.
      • Fig.3 sup.1: bleaching
      • Fig.3 sup.2: Mac, Ace, jRGECO
      • slice, AOD2P
  • ex vivo, slice culture
    • Figure 4
      • Fig.4: slice culture. AOD2P
        • D: response to current-evoked AP. 925Hz with 20 voxel. 10 trials average trace
        • F: single-trial response to spontaneous APs.
      • Fig.4 sup.1: effect to excitability
      • Fig.4 sup.2: single-trial trace of spontaneous APs
      • Fig.4 sup.3: ASAP1 & 2"f" 10-trial averaged trace
      • Fig.4 sup.4: Ace2N-4AA
    • Fig.5: slice culture. subthreshold depol. & hyperpol. single-trial traces & averaged
    • Figure 6
      • Fig.6: slice culture.
      • B: 10-trial average(gray) & 5-point moving average (color)
      • Fig.6 sup.1: bleaching
      • Fig.6 sup.2: ASAP1 & 2"f"
      • Fig.7: detection & Noise
    • Fig.7 sup.1: ASAP1 & 2"f"
    • Figure 8
      • Fig.8: slice. 10-trial average trace, bleach correction.
      • Fig.8 sup.1: detectability
      • Fig.8 sup.2: ASAP1 & 2"f"
    • Fig.9: slice culture. single-voxel single-trial 50 us dwell time trace
    • Fig.9 sup.1: ASAP1 & 2"f"
    • Fig.10: single cell AP propagation. 31-trial average trace
    • Fig.10 sup.1:

organotypic hippocampal slices:

6-8 day old wistar rats slice. cultured for 7 to 14 days

electroporation and culture for 7days.

局在の重要性

次のやつらは反応しない

• internal membrane
• aggregates

zebra

imaging

web of science:

検索項目: トピック: (zebrafish) ANDトピック: (imaging) AND ドキュメントタイプ: (Review) タイムスパン: 2015-2017. 

• Seeing the whole picture: A comprehensive imaging approach to functional mapping of circuits in behaving zebrafish
• Live imaging of nervous system development and function using light-sheet microscopy
• A tale of two species: Neural integration in zebrafish and monkeys
• Fish-on-a-chip: microfluidics for zebrafish research
• Chapter 6 - Single neuron morphology in vivo with confined primed conversion
• Chapter 3 - Second harmonic generation microscopy in zebrafish
• Defects of the Glycinergic Synapse in Zebrafish
• A guide to light-sheet fluorescence microscopy for multiscale imaging
• Zebrafish Behavior: Opportunities and Challenges

みるならCa imaging のarticleを読んだ方がいいかな

Ca2+ imaging

• Pan-neuronal calcium imaging with cellular resolution in freely swimming zebrafish (2017)
  • ステージとpiezoでfreely moving zebrafishをtrack, 同時にCa2+ imaging
• Whole-brain functional imaging at cellular resolution using light-sheet microscopy (2013)
  • 体を固定、ライトシートで撮影
• Fast functional imaging of multiple brain regions in intact zebrafish larvae using Selective Plane Illumination Microscopy (2013)
• a

in vivo patch clmap:

• "Whole-cell patch-clamp recordings from identified spinal neurons in the zebrafish embryo"
• "Paired Patch Clamp Recordings from Motor-neuron and Target Skeletal Muscle in Zebrafish"
  • 断頭して剥がしてる
• "Patch Clamp Recordings from Embryonic Zebrafish Mauthner Cells"
  • 剥がしてる
• "Locomotor Pattern in the Adult Zebrafish Spinal Cord In Vitro"
• "Paired Motor Neuron–Muscle Recordings in Zebrafish Test the Receptor Blockade Model for Shaping Synaptic Current"
• Rong-wei Zhang & Jiu-lin Du. "In Vivo Whole-cell Patch-Clamp Recording in the Zebrafish Brain". DOI: 10.1007/978-1-4939-3771-4_19.
  • 1% LM-agar. 水吸って、そこにagar添加
  • holding: -60 mV

spinal cord of larvae

• motor neuron
  • Primary motor neuron (PMNs)
    • RoP: Rostral Primary
    • MiP: Middle Primary
    • CaP: Candaul Primary
    • VaP:
  • Secondary motor neuron
  • spinal accessory motor neuron
  • cranial motor neuron
• interneuron
  • CoPA
  • CoSA
  • CiD
  • VeLD
  • DoLA
  • CiA
  • CoB
• Sensory neuron
• neuroepithelial cells
• floor plate cells
• laterally placed cells: 18 cells (18-20 hpf, maybe post-mitotic cells)
• i

形態

脊髄の中央にはGFAP+の細胞集団(少なくともradial gliaの一部のpolulation)が居座っている.

これらの集団からlateralの位置にHuC+の細胞集団が存在している。GFAP+だった細胞集団から派生してきている奴らもいる.

24 hpf ~ 48 hpfだと、縦に10細胞ならぶくらい。横だと6~8くらい？ (Fig.1 ~2から類推)(電顕データも)

interneuron

形態学的に7つのクラスに分類可能(Bernhardt. 1990)。着目点は3つ。軸索のtrajectory, 求心性/遠心性, 細胞体の位置。分類・命名規則は以下の通り。

• Axonal trajectory
  • commissural / Co
  • circumferential / Ci
  • longitudinal / L
• 遠心性/求心性
  • ascending / A
  • descending / D
  • bifurcated / B
• 細胞体の位置
  • dorsal / Do
  • ventral / Ve
• おまけで
  • primary / P
  • secondary / S

これに従って分類するとlarvaeのinterneuronsは

• CoPA
• CoSA
• CiD
• VeLD
• DoLA
• CiA
• CoB

ただし、上の分類は蛍光顕微鏡撮影なのでかなりアバウト。confocalを使ってさらに厳密に検証が行われた(Melina E. H. 2001)。でもdye injectionなので染まらなかったり局所が見えなかったりが予想されている。

• Ascending interneurons
  • CoPA
  • CoSA
  • CoLA: new!
• Descending interneurons
  • CiD
  • MCoD: Muctipolar CoD. VeLDを良くよく調べたら、なんとCoでした
  • UCoD: Unipolar CoD. new!
  • VeMe: Ventral Medial. new!
• Bifurcating interneurons
  • CoBL: embryonic CoBの成長したやつと予想される

KA cell?

embryonic spinal cord (18 hpf)

total: 18.3 cells/hemisegment (range: 13-25), 18-20 hpf, with DIC optics

c.f. with anti-acetylated_tublin antibody: 4.28 cells/hemisegment, 18 hpf

five-class axogenesis neurons

• PMNs
• RB: 1.1 cells/hemisegment with antibody => not yet axogenesis
• ascending commissural (CoPA? CoSA?)
• DoLA: rare, dead in larvae?
• VeLD: 1.1 cells/hemisegment with antibody

later (24-25 hpf)

• CiD
• CiA
• CoB

larvae spinal cord (4 dpf)

PMNs: 1 per 1type

SMNs: up to 20

RB: 1 - 4 (detection by HRP)

interneurons: 7 class

* CoPA: 1 cell/hemisegment

* CoSA: up to 5/hemisegment

* CiD: up to 3/hemisegment

* VeLD: up to 2/hemisegment

遺伝学的

vsx2 (alx, Chx10) ポジの細胞が全部 ipsilatellal descending neuron. それでglutamatergic. ipsilatellal descending neurons のほとんどがvsx2 posだった。

spinal V2aニューロン

spinal cordに存在するChx10陽性ニューロン (hindbrainのとは別)。

CiD (mainがDescendingだけどAscending aborも持ってる) に加えて、Descendingしか持たないうえに変な分岐をしてるやつがいる(dorsally displaced cells)

V2a細胞は脊髄のほぼ全segmentに20 cells/hemisegmentほどで存在する(4-5 dpf)。尾部の尾部にはあまりいない。

CiDとDorsally dispaced cellsで分けると、segment numberによって含有率が大きく異なる。segment 1-5 では60%ほどがCiDだが、segment20あたりではCiDは10%ほど。面白いことにaxonal lengthとsegmentの位置には相関がない。直感的には後ろに行くほど短くなるんだが。

Evdokia et al., 2014はascendingの有無で

• V2a-B
• V2a-D

に二分して議論している。

脊髄V2aニューロンのablationによって、hemisegment間の協調がおかしくなることがわかった

運動ニューロン

ゼブラフィッシュの運動ニューロンは、次のサブタイプに分類できる。

• motor neuron
  • Primary motor neuron (PMNs)
    • RoP: Rostral Primary
    • MiP: Middle Primary
    • CaP: Candaul Primary
    • VaP:
  • Secondary motor neuron
  • spinal accessory motor neuron
  • cranial motor neuron

Primary MNs

10hpfで生まれ、11.5 hpfにOlig2を発現し始める(いつ消える？)。PMNsは17~19hpfに軸索を伸長し始める。大人になってもlarvaeと変わらず 1RoP, 1MiP, 1CaP / segment。ちなみにゼブラフィッシュの体節数は30。各サブタイプは投射パターンに追加して、電気生理学的にも差異がみられる。しかし各サブタイプは独立しているのではなく、お互いに影響し合っていると考えられる。PMNsに該当する運動ニューロンはヒトで見つかっていない。

Secondary MNs

secondary motor neuronsはPMNsから数時間遅れて出現・分岐する運動ニューロンである。16-25 hpfで生まれる。PMNsと比較して小さい。また少数の筋を支配している。NeurolinがPMNとの識別マーカー。Olig2の発現がある模様。（SMNsの数は？）

ヒレを制御する運動ニューロンは通常のPMNとは性質が異なる (Islet1を発現していない)

> Slow fibers are activated during slow sustained swimming, whereas fast fibers only become active during rapid swimming or escape movements 

"Evolution of Patterning Systems and Circuit Elements for Locomotion"

ヒトと異なり、終脳 (大脳) から脊髄への直接投射が存在しない。 c.f. マウスなど

gap junctionの形成が確認されている。

MNsの発生

発生に重要な遺伝子はislet1, islet2, olig2などが有名。miR-218が必要との報告もある。

PMNとSMNは違う起源との話もあるようだが、読めてない。

larvae運動ニューロンの形態と発生文献

author	year		journal
Myers	1985	Motoneurons of the Larvae Zebrafish	J. Comp. Neuro	HRP to muscle or root. zebrafish PMNsとSMNsの形態
Myers, et al.	1986	Development and Axonal Outgrowth of Identified Motoneurons in the Zebrafish	JNS	larvaeでRoP, MiP, CaPの名づけと詳細な解析
Westerfiled, et al.	1986	Identified Motoneurons and Their Innervation of Axial Muscles in the Zebrafish	JNS	adultでのRoP, MiP, CaP同定 (Myers 1986と同時発表)

MNとOPCの起源

いわゆるpMNドメインからは運動ニューロンのみならず、オリゴデンドロサイトが生み出される。

当然、運動ニューロン(MNs)とオリゴデンドロサイト(の前駆細胞、OPC)が同一のprogenitor cellから生み出されるのか (common progenitor model)、そうでないのかはみんな気になる。

喧々諤々の論争が続いている模様だが(いや、たぶんね)、かなり有力なlineage-traceの論文が出ていた。非常にきれいな仕事、まさにgeneticsとimagingの融合。この論文では、common progenitor modelではなく、かつ単純にpMNドメインがヘテロなのではなく、pMNドメインへ途中で移動してくる細胞集団がOPCになっていく、というprogenitor recruitment modelなのだと主張している。

介在ニューロン

V0介在ニューロン

• V0
• V0d: in
• V0v: ex
• further 3 subtype
• MCoD

interneuron

• CoPA: Commissural Primary Ascending interneuron

マーカー

• dbx1
• dbx2
• evx1
• pitx1

https://sites.ualberta.ca/~nikolai/pdf/fraser_pdf.pdf

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/m/pubmed/11239430/?i=2&from=/11239429/related

DMRT3

DMRT3 (Doublesex and mab-3 related transcription factor 3)は動物の歩行に関わる遺伝子である。転写因子をコードしている。

馬の歩様に関わることがGWSによって示唆され、マウスによって証明された。

発見と命名

DMRT1-3のホモログが存在する。

dI6 INsのsub population

ショウジョウバエのdoublesex (dsx)、線虫のmab-3と近縁？

> Genes related to the Drosophila melanogaster doublesex (dsx) and Caenorhabditis elegans mab-3 genes encode transcription factors conserved during evolution

> http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0012160607012286

ニューロンでの発現

dI6ニューロンの少なくとも一部のpopulationに発現している。

ゼブラフィッシュでは、DMRT3a positiveニューロンはすべてGlyT positive, vglut2a&gad1b negativeであった。

遺伝子改変ゼブラフィッシュの作成

Improved Translation Efficiency of Injected mRNA During Early Embryonic Development　http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/dvdy.20995/pdf

http://www.cell.com/current-biology/fulltext/S0960-9822(95)00185-0?_returnURL=http%3A%2F%2Flinkinghub.elsevier.com%2Fretrieve%2Fpii%2FS0960982295001850%3Fshowall%3Dtrue

zygoteへのエレポは報告されていないはず

50 psi, 30 ms. 2-5 nL (==Φ100 um)

その他

> different gene transfer methods have already been tried on eggs, e.g. gun particle bombardment [6], sperm binding [7] and sperm electroporation [8], but the efficiency of these methods did not reach that of microinjection.

マイクロインジェクション

マイクロインジェクションによる核酸・タンパク質の受精卵導入

(1988) 最初の論文. Stuart. "Replication, integration and stable germ-line transmission of foreign sequences injected into early zebrafish embryos"

(1991) PATRICIA CULP, et al.. "High-frequency germ-line transmission of plasmid DNA sequences injected into fertilized zebrafish eggs"

エレクトロポレーション

別記事

エレクトロポレーション

sgRNA/Cas9 実績: http://www.nepagene.jp/publications01.html#Zygotes

歴史的論文

(1982) in vitro DNA transfection by electroporation "Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields."

electroporation to zygote

"Nucleic acids delivery methods for genome editing in zygotes and embryos: the old, the new, and the old-new"

CRISPR

2014-10 TAKE "Simple knockout by electroporation of engineered endonucleases into intact rat embryos"

2015-06 "Electroporation enables the efficient mRNA delivery into the mouse zygotes and facilitates CRISPR/Cas9-based genome editing"

2015-11 TAKE "Simple Genome Editing of Rodent Intact Embryos by Electroporation"

2016-05 CRISPR-EZ: Cas9/sgRNA-RNP "Highly Efficient Mouse Genome Editing by CRISPR Ribonucleoprotein Electroporation of Zygotes"

into intact egg

2014	rat	RNA (ZFN, TALEN, Cas9{w/ gRNA})	3-step. [225V, 1.5msec;50msec]x4;transfer1;2;
2015	mouse & rat	RNA (Cas9 mRNA, gRNA, ssODN)	[225V, 2.5msec; 50msec]x4;[20V, 50msec;50msec]x5;[-20V, same]x5

electroporation to zygote of fish

medaka (1990) transgenic animal作成で初めてelepo使ったと主張"Electroporation as a new technique for producing transgenic fish"

zebrafish (1991) 再現性が取れていない (by Muller 1993) "transgenic zebrafish by electroporation"

cannot access (1992) "Electroporation: a method for transferring genes into the gametes of zebrafish (Brachydanio rerio), channel catfish (Ictalurus punctatus), and common carp (Cyprinus carpio)."

zebrafish, catfish and rosy barb (1993) "Efficient transient expression system based on square pulse electroporation and in vivo luciferase assay of fertilized fish eggs."

zebrafish (1998) やたら効率がいい "Construction, electroporatic transfer and expression of ZpβypGH and ZpβrtGH in zebrafish"

		egg	DNA	pulse shape	distance	F0 analysis	F1 analysis	w/o dechorionate
1990	medaka	innate	linear, 100 ug/mL	exp (750 V/cm, 50 μs/ 1s, 5 times)	2 mm	4% of hatch	5% of adult-F0	-
1991	zebra	innate	linear, 100 ug/mL	exp (125 V/cm, 7-10msec/1s, 3 times), 0.25 uF	4 mm	65% of alive	-	-
1993	zebra	dechorionated Pronase E XXV	circular, 50 ug/mL	square (100 V/cm, 0.2msec/0.5msec, 16 times)	8.5 mm	20% of alive	-	0%
1998	zebra	innate?	circular, 100 ug/mL	exp (70V, ?/1s, 2 times), 25 uF				-

electroporation in zebrafish, expect for zygote

• "Focal Electroporation in Zebrafish Embryos and Larvae". doi: 10.1007/978-1-60327-977-2_10

　　　　微小電極でのエレポでsingle-cell or small-populationに導入.

　　　　必要な道具・手法等を網羅、素晴らしい

• "Electroporation of DNA, RNA, and morpholinos into zebrafish embryos"
• "DNA delivery into anterior neural tube of zebrafish embryos by electroporation"
• "Targeted Electroporation in Embryonic, Larval, and Adult Zebrafish" doi: 10.1007/978-1-4939-3771-4_17
• "Fast gene transfer into the adult zebrafish brain by herpes simplex virus 1 (HSV-1) and electroporation: methods and optogenetic applications"
• "Brain asymmetry is encoded at the level of axon terminal morphology"
• "The Temporal Resolution of In Vivo Electroporation in Zebrafish: A Method for Time-Resolved Loss of Function"
• http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/dneu.22158/full

electroporation in other species

"Introduction of Foreign Genes into Silkworm Eggs by Electroporation and Its Application in Transgenic Vector Test"

parameters

type	target	distance	voltage	duration/repeat	Tg success rate	from
in Utero	plasmid	~10 mm?	30 V	[50 ms / 950 ms] x4	-	慶應プロトコル
CRISPR-EZ	RNP	1 mm	30 V	[3 ms / 100 ms] x2
mouse zygote	mRNA + gRNA (+ ssODN)	1 mm	30 V	[3 ms / 97 ms] x7	高そう、けど不明(3/3)
medaka zygote	plasmid	2 mm	750 V/cm	[50 us / 1 s] x5	2/3109

卵膜(chorion)の除去

https://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt4/4.1.html

若いとうまくいかないとの2011年報告あり

Embryo medium

dechorionしたらこれを使わないといけない模様.

ZFIN

HBSS組成(ronza)

ちなみにE3 medium

Name	Mw	in HBSS[mg/L] ronza	in HBSS ronza[mM]	ZFIN
NaCl	58.4	8000	136.99	137
KCl	74.5	400	5.37	5.4
Na2HPO4/7H2O	268	90	0.34	0.25
KH2PO4	136	60	0.44	0.44
CaCl2/2H2O	147	186	1.27	1.3
MgSO4•7H2O	246	200	0.81	1
NaHCO3	84	350	4.17	4.2

CRISPR

good review: "CRISPR-Based Technologies for the Manipulation of Eukaryotic Genomes"

sgRNAが動くと示した論文？

gRNA短くしたらoff-target減ったよ論文 "Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs"

proteinでKOするとどんな時間スケールで反応がおきるか

single plasmid

(2013) "Generation of mutant mice by pronuclear injection of circular plasmid expressing Cas9 and single guided RNA"

. pX330 == pSpCas9(BB)(hCas9 +1x sgRNA), circular, microinjection to pronuclei

. F0: about 50%, Cas9 carrier: 2/46, KO in sperm (germ-line) was seen in F0s

(2013) Nature Methods "Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system"

(2014) "Feasibility for a large scale mouse mutagenesis by injecting CRISPR/Cas plasmid into zygotes"

. 2013のGeneration..と同じラボ、ほぼ同じ

(2014) "Multiplex genome engineering in human cells using all-in-one CRISPR/Cas9 vector system"

. gatewayでsgRNAカセットをタンデムに繋ぎ、同時KO

(2014) "Validation of microinjection methods for generating knockout mice by CRISPR/Cas-mediated genome engineering"

(2015) "Production of knockout mice by DNA microinjection of various CRISPR/Cas9 vectors into freeze-thawed fertilized oocytes"

. 2014のmultiplexとほぼ変わらず

pSpCas9(BB)

SpCas9とsgRNA-backboneがセットになったプラスミド。いくつかの変種がある。

pSpCas9(BB)-2A-GFP == CAG:nls-SpCas9-nls-2A-GFP/U6:gRNA_backbone

基本的にこれを使えば間違いないが、zebrafish optimizedとか改良型SpCas9とかは検討必要かも

gRNAはBbs1 restriction enzymeで切って入れる感じ

zebrafish

mRNA or proteinのmicroinjectionが主流. off-targetとheterogeneityが理由.

review

"Zebrafish Genome Engineering Using the CRISPR–Cas9 System"

"Genome editing using CRISPR/Cas9-based knock-in approaches in zebrafish"

"Chapter Eighteen - Cas9-Based Genome Editing in Zebrafish"

"Site-Specific Integration of Exogenous Genes Using Genome Editing Technologies in Zebrafish"

●"Exogenous gene integration mediated by genome editing technologies in zebrafish"

zCas9

的なやつが2つ

"Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system"

"Efficient Gene Targeting in Zebrafish Mediated by a Zebrafish-Codon-Optimized Cas9 and Evaluation of Off-Targeting Effect"

https://www.addgene.org/47929/

history & technology

(2013) 初のzebrafish CRISPR/Cas9. KO (mRNA+gRNA) "Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system"

(2013) KO (mRNA+gRNA), lox KI(mRNA+gRNA+ssODN) "Genome editing with RNA-guided Cas9 nuclease in Zebrafish embryos"

(2013) homology-indipendent KI "Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair"

. 後追い "Efficient generation of knock-in transgenic zebrafish carrying reporter/driver genes by CRISPR/Cas9-mediated genome engineering"

. 派生版？ KI "Precise in-frame integration of exogenous DNA mediated by CRISPR/Cas9 system in zebrafish"

. 力技でexonに影響のない KI "Intron targeting-mediated and endogenous gene integrity-maintaining knockin in zebrafish using the CRISPR/Cas9 system"

(2014) SNP KI (HDR, circular plasmid) "Precise and efficient genome editing in zebrafish using the CRISPR/Cas9 system"

●(2016) "Precise Editing of the Zebrafish Genome Made Simple and Efficient"

●(2017) "CRISPR/Cas9-Mediated Zebrafish Knock-in as a Novel Strategy to Study Midbrain-Hindbrain Boundary Development"

. HITIでfirst-ATGの前にレポーター入れたら元の遺伝子に影響なかったよ。good論文

とりあえず

"Multiple genome modifications by the CRISPR/Cas9 system in zebrafish

"Efficient CRISPR/Cas9 genome editing with low off-target effects in zebrafish"

"CRISPR/Cas9-mediated conversion of eGFP- into Gal4-transgenic lines in zebrafish"

"Precise and efficient genome editing in zebrafish using the CRISPR/Cas9 system"

"Egg cell-specific promoter-controlled CRISPR/Cas9 efficiently generates homozygous mutants for multiple target genes in Arabidopsis in a single generation."

"Applications of CRISPR-Cas systems in neuroscience"

doi: 10.1016/bs.mcb.2016.04.023 "The zebrafish genome editing toolkit"http://tm3xa4ur3u.search.serialssolutions.com/?url_ver=Z39.88-2004&url_ctx_fmt=info:ofi/fmt:kev:mtx:ctx&rft_val_fmt=info:ofi/fmt:kev:mtx:book&rft.atitle=The%20zebrafish%20genome%20editing%20toolkit&rft.aufirst=H%2E&rft.aulast=Ata&rft.btitle=ZEBRAFISH%3A%20GENETICS%2C%20GENOMICS%2C%20AND%20TRANSCRIPTOMICS%2C%204TH%20EDITION&rft.date=2016&rft.epage=170&rft.genre=bookitem&rft.isbn=978-0-12-803474-3&rft.issn=0091-679X&rft.pages=149-170&rft.place=SAN%20DIEGO&rft.pub=ELSEVIER%20ACADEMIC%20PRESS%20INC&rft.series=Methods%20in%20Cell%20Biology&rft.spage=149&rft.tpages=22&rft.volume=135&rfr_id=info:sid/www.isinet.com:WoK:WOS&rft.au=Clark%2C%20K%2E%20J%2E&rft.au=Ekker%2C%20S%2E%20C%2E&rft_id=info:pmid/27443924&rft_id=info:doi/10%2E1016%2Fbs%2Emcb%2E2016%2E04%2E023

"CRISPRz: a database of zebrafish validated sgRNAs"

"Efficient identification of CRISPR/Cas9-induced insertions/deletions by direct germline screening in zebrafish."

"Maximizing mutagenesis with solubilized CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein complexes"

"Genome editing in zebrafish: a practical overview"

"Zebrafish Genome Engineering Using the CRISPR–Cas9 System"

HDR

"Efficient precise knockin with a double cut HDR donor after CRISPR/Cas9-mediated double-stranded DNA cleavage"

HMEJ

"Homology-mediated end joining-based targeted integration using CRISPR/Cas9"

PITCh

"MMEJ-assisted gene knock-in using TALENs and CRISPR-cas9 with the PITCh systems"

●"Microhomology-mediated end-joining-dependent integration of donor DNA in cells and animals using TALENs and CRISPR/Cas9"

HITIの原理関連

●"Is Non-Homologous End-Joining Really an Inherently Error-Prone Process?"

●HITI…? "In vivo blunt-end cloning through CRISPR/Cas9-facilitated non-homologous end-joining"

使えそう

"Rapid reverse genetic screening using CRISPR in zebrafish"

アイデア

お姉さんの実験をzebrafishでぱぱっと

その他

"A history of genome editing in mammals"

"High-throughput screening of a CRISPR/Cas9 library for functional genomics in human cells"

●"In trans paired nicking triggers seamless genome editing without double-stranded DNA cutting"

"Chapter 24 - New frontiers for zebrafish management"

"CRISPR Guide RNA Validation In Vitro"

"Genetic targeting and anatomical registration of neuronal populations in the zebrafish brain with a new set of BAC transgenic tools"

KI

2016-01 "ssODN-mediated knock-in with CRISPR-Cas for large genomic regions in zygotes"

2017-08 sequential lox introduction

●(2016) "In vivo genome editing via CRISPR/Cas9 mediated homology-independent targeted integration"

zebraとかで示されてきたNHEJ-basedなKIをnon-devideing cellに使い、かつ治療PoCとしてin vivo適用したよ。ねじ込み感が凄い...

HDR: homologus recombination

PITCh: MMEJ

HITI: NHEJ-based (homology-independent targeted integration)

ssODN

single-stranded oligodeoxynucleotide

一本鎖オリゴDNA

ゲノム編集での利用

small DNA fragment挿入時のテンプレートとして利用される。dsODNを用いるより効率がいい。

IDTで注文可能 http://sg.idtdna.com/jp/site/index.html#Ultramer

2H2OP / two-hit by gRNA and two oligos with a targeting plasmid

recipient genomeをgRNAで切断し、donor plasmidも別のgRNAで切断。plasmid切断部位のssODNおよびplasmid 3`のssODNを添加してHDR-KI

We named this strategy ‘two-hit by gRNA and two oligos with a targeting plasmid’ (2H2OP)

2-hit 2-oligo with plasmid

base edit

●Effective gene editing by high-fidelity base editor 2 in mouse zygotes

"Programmable base editing of zebrafish genome using a modified CRISPR-Cas9 system"

大脳基底核 - basal ganglia

outputがtonic GABAなので、その有無が何よりも重要ではないかね？

種間比較

大脳基底核は種をまたいで基本構造がほぼ同じ

GPi

primateの淡蒼球内節 (GPi), mammalの脚内核 (entopeduncular nucleus / EP), zebrafishの背側脚内核 (dorsal entopeduncular nucleus, ENd)が相同か。

zebrafish

> 終脳の外套下部（subpallium）に位置する終脳腹側部背側核（dorsal nucleus of area ventralis telencephali；以下 Vd とする）

> Vd は哺乳類における線条体の相同機関であると提唱されている（Rink and Wullimann, 2001; Mueller et al., 2008)

> ゼブラフィッシュにおける Vd から脚内核への投射に相当するのが、 哺乳類における線条体から淡蒼球への投射であるのではないかと推測された（図 2- 10B）。

> 本研究で同定された直接経路、間接経路の細胞 群は離れた領域に存在していた。これらの不一致は、進化の過程で発生過程の細胞 種特異的な細胞移動に変化が起こったことを示唆している。この仮説に一致して、硬 骨魚類より早く哺乳類と別れて進化した円口類に属するヤツメウナギでも、直接経路 の神経細胞と間接経路の神経細胞が離れて存在することが明らかになっている （Stephenson-Jones et al., 2011）。

zebrafishは ventralとdorsalに分けられている。終脳の腹側、最外側に位置している (from atlas)。ENdはGAD67positive領域であり、NPY positive細胞が存在している。

"Subdivisions of the Adult Zebrafish Subpallium by Molecular Marker Analysis"

SNr/GPi - PPTg 結合

双方向に結合.

> The SNr sends a prominent GABAergic projection to the PPN that innervates both cholinergic and glutamatergic neurons. [17].

> This nigral output inhibits the activity of cholinergic [40–42] and non-cholinergic [41] neurons of the PPN.

"Pedunculopontine nucleus and basal ganglia: distant relatives or part of the same family?"

"Nigral Innervation of Cholinergic and Glutamatergic Cells in the Rat Mesopontine Tegmentum: Light and Electron Microscopic Anterograde Tracing and Immunohistochemical Studies"

PPTgと動物種

黒質網様部 - Substantia Nigra pers reticulata

"Neurons of GPi/SNr" of "The Basal Ganglia Over 500 Million Years"

SNr GABAnergic neuronsが30 Hzでspontaneous firing

spontaneous firingの実体

Andrew Lutas, et al.. (2016) "The leak channel NALCN controls tonic firing and glycolytic sensitivity of substantia nigra pars reticulata neurons"

leak currentはNALCNが大きく担っている。綺麗な仕事。

まとめの本

欲しい "handbook of basal ganglia structure and function, second edition"

https://books.google.co.jp/books?id=vId4CgAAQBAJ&pg=PA1013&lpg=PA1013&dq=handbook+of+basal+ganglia+structure+and+function,+second+edition&source=bl&ots=-Lk845Kj8N&sig=EOyCIeVJu-5fvKRhwVxTNTZTmEU&hl=ja&sa=X&ved=0ahUKEwjG7pi4otvWAhVFS7wKHTNLBi8Q6AEIVDAG#v=onepage&q=neurophysiology%20of%20substantia%20nigra%20dopamine%20neurons&f=false

発生

https://link.springer.com/article/10.1007%2Fs00429-014-0980-9

淡蒼球内節 - GPi / globus pallidus intemus?

GPiのGABAergic neuronはtonic firingしているのか否か

rat EPではしてる。"Electrophysiological characterization of entopeduncular nucleus neurons in anesthetized and freely moving rats"

zebrafish EN

GAD67 mRNA発現

CST

ベッツ細胞

すごい良い https://bsd.neuroinf.jp/wiki/%E4%B8%80%E6%AC%A1%E9%81%8B%E5%8B%95%E9%87%8E#cite_note-ref23-22

DiO/DPA

DiO/DPAの染色条件・方法

original paper:

DiO -> incubation or patch clamp

• HEK293 cells
  • incubation
    • DiO final 5-10 uM in HEPES-based external solution
    • 2 min
  • patch clamp (cell-attached)
    • patch solution: external solution
    • DiO final 1.8 uM
    • 15 sec ~ 3 min
• cultured (rat?) hippocampal neurons
  • incubation
    • DiOC16 final 4-10 uM
    • 2 min?
    • 37℃ incubationでlabel増加
  • patch clamp
    • patch solution: normal
    • DiO final 5 ~ 10 uM
• mouse cerebellar slice
  • patch clamp

DiO stock: 1.8 mM in dimethylformamide

staining: DiOC16 > DiOC18

DPA

DPA stock: 20 mM in DMSO

superfusion ~1 ml/min. within 3min, start staining, become max within 10min.

slice:

>30min preincubation by bath application

GABAAのantagonistとしてDPAが働く…？

Hydrophobic anions potently and uncompetitively antagonize GABAA receptor function in the absence of a conventional binding site

https://doi.org/10.1111/j.1476-5381.2011.01396.x

NMDARのantagonistとしても働くよ、という同じグループの論文。capacitanceなんじゃねぇの…？

Noncompetitive, Voltage-Dependent NMDA Receptor Antagonism by Hydrophobic Anions

10.1124/mol.112.081794

DPA投与hVOS2.0利用文献

全部bath application…あらまぁ…

hVOS2.0開発論文(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3042572/)からの引用web of science 2017-07-08T16:30+09:00

title	labeling	DOI
hVoS2.0開発論文
Single-trial imaging of spikes and synaptic potentials in single neurons in brain slices with genetically encoded hybrid voltage sensor	bath	10.1152/jn.00691.2014
Hybrid voltage sensor imaging of eGFP-F expressing neurons in chicken midbrain slices	bath	10.1016/j.jneumeth.2014.05.034
Hybrid voltage sensor imaging of electrical activity from neurons in hippocampal slices from transgenic mice	bath	10.1152/jn.00722.2012

DiO/DPAを利用したほかの論文

Web of Science original paperに対する引用検索. review除外で検索. 合計44件 hit 2017-07-07T19:00+09:00

DiO/DPAをVSDとして利用した論文はoriginal paper含め合計7本.

year	purpose	DiO	labeling methods	authors	doi
2009	original article	C16&18 (16>18)	(culture & slice) DiO: bath patch (cell-attached) DPA:	Jonathan Bradley Ray Luo Thomas S. Otis David A. DiGregorio	10.1523/JNEUROSCI.1240-09.2009
2012	subcomponent, 2PM	C16	(all slice) DiO: patch (whole-cell) iontophoresis DPA: 45 min pre-incubation + bath 2uM	Ann E. Fink Kevin J Bender Laurence O. Trussell Thomas S. Otis David A. DiGregorio	10.1371/journal.pone.0041434
2013	2PM開発. 評価にDiO/DPA	C16	bath	Mathieu Ducros Yannick Goulam Houssen Jonathan Bradley Vincent de Sars Serge Charpak	10.1073/pnas.1307818110
2015	高速スキャンFTM法開発 評価にDiO/DPA	C16&18	patch(whole-cell)	Matthew Shtrahman Daniel B. Aharoni Nicholas F. Hardy Dean V. Buonomano Katsushi Arisaka Thomas S. Otis	10.1016/j.bpj.2014.12.005
2016	AOD2PMで多点Vm DiO/DPA	C18	gene-gun	Nasrin Shafeghat Morteza Heidarinejad Noboru Murata Hideki Nakamura Takafumi Inoue	10.1016/j.jneumeth.2016.01.023
2016	小脳シナプス統合 DiO/DPAをメイン武器	C16	patch(whole-cell)	Alexandra Tran-Van-Minh Therese Abrahamsson Laurence Cathala David A. DiGregorio	10.1016/j.neuron.2016.07.029
2017	patch技術開発 評価にDiO/DPA	C18	special	Matthias Garten Lars D. Mosgaard Thomas Bornschlogl Stephane Dieudonne Patricia Bassereau Gilman E. S. Toombes	10.1073/pnas.1609142114

面白そう

Photoacoustic imaging of voltage responses beyond the optical diffusion limit

10.1038/s41598-017-02458-w

GCaMPs

GEVIは英語版wikipediaにお引越し

　GCaMPs

センサー名	発表年	二光子適用	論文	著者	改良点
GCaMP3	2009-11		10.1038/nmeth.1398
GCaMP-HS	2011-03		10.1073/pnas.1000887108	Ohkura, Nakai, et al.
GCaMP5 series	2012-10		10.1523/JNEUROSCI.2601-12.2012	著者だらけ
G-CaMP6	2012-12		10.1371/journal.pone.0051286	Ohkura, Nakai, et al.
G-CaMP7	2012-12		10.1371/journal.pone.0051286	Ohkura, Nakai, et al.	G-CaMP6 S205N
G-CaMP8	2012-12		10.1371/journal.pone.0051286	Ohkura, Nakai, et al.	G-CaMP7 I47F
GCaMP7a	2013-02		10.1016/j.cub.2012.12.040	Ohkura, Nakai , et al.
GCaMP6s, m, f	2013-07		10.1038/nature12354	Tsai-Wen Chen, Douglas S. Kim all author Tsai-Wen Chen, Trevor J. Wardill, Yi Sun, Stefan R. Pulver, Sabine L. Renninger, Amy Baohan, Eric R. Schreiter, Rex A. Kerr, Michael B. Orger, Vivek Jayaraman, Loren L. Looger, Karel Svoboda & Douglas S. Kim	mega-screening
Fast-GCaMP6f series	2014-10		10.1117/1.NPh.1.2.025008	Aleksandra Badura ;  Xiaonan Richard Sun ;  Andrea Giovannucci ;  Laura A. Lynch ;  Samuel S.-H. Wang	very fast kinetics	以後の改良verは出てな い模様 (web of sci. 引用でチェック)
G-CaMP7.09	2016-10		10.1038/nature19815
GCaMP6fu	2016-12		10.1038/srep38276	Nordine Helassa Borbala Podor Alan Fine Katalin Török	mGCaMP6f RS-1 EF-3 (W43Y, D395A)

> After GCaMP3, improvements in GCaMP have diverged into two paths, one focused on brightness and the other focused on speed.

> http://neurophotonics.spiedigitallibrary.org/article.aspx?articleid=1919022

Ohkura Masamichi

https://scholar.google.co.jp/citations?hl=ja&user=L9S1jdgAAAAJ&view_op=list_works&sortby=pubdate

>  GCaMP5 was engineered from GCaMP3 using a combination of structure-guided design (Akerboom et

l., 2009)

d semirati

= Brain-Machine Interfa　　　　　　　　　

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table. BMIの研究例

発表年	内容	開発者	方法	備考	DoF	論文	参考資料
1988	文字入力	L.A. Farwell, et al.	脳波(EEG)
1988	population coding	Apostolos P. Georgopoulos, et al.	細胞外記録	たぶんこれ		[29]
1999	マウス1D水取り	John K. Chapin, et al.	細胞外記録		1	[30]
1999	脊髄損傷患者による物体把持	Richard T. Lauer, et al.	脳波(EEG)	β波の検知→外部からの筋肉刺激による物体把持		[31]
2000	サルにおける腕運動の三次元軌跡予測	Johan Wessberg, et al.	細胞外記録	多電極・多領域記録を線形回帰 or ANNでdecoding	-	[32]
2004	コンピュータカーソルの2次元操作	Jonathan R Wolpaw, et al.	脳波(EEG)			[33]
2006	コンピュータカーソルの2次元操作	Leigh R. Hochberg, et al.	細胞外記録			[34]
2008	見たものを画面上に再現	Yoichi Miyawaki, et al.	fMRI			[35]	[36][37]
2012	ロボット義手の三次元操作および把持操作	Leigh R. Hochberg, et al.	細胞外記録(SUA)	アメリカの"BrainGate"臨床研究	4	[38]	[39][40]
2013	ドローンの現実空間における操縦	Karl LaFleur, et al.	脳波(EEG)		2	[41]